醒脑益智剂联合罗格列酮改善2型糖尿病小鼠记忆障碍的作用机制

1.成都中医药大学临床医学院，四川 成都 610072；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610042； 3.重庆市中医院，重庆 400010；4.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072

糖尿病性记忆障碍也可称为“3型糖尿病”[1-2]，是老年期痴呆中较为常见的一种慢性进行性中枢神经系统性病变[3-4]。根据长期的临床观察发现，本病多以肾虚为本，痰浊、血瘀为标[5-6]，从而确立了以“胰-肾-脑”轴为指导的补肾醒脑法，现已制成院内合剂-醒脑益智剂，但其作用机制尚未明确。故本实验在建立稳定的2型糖尿病性记忆功能障碍小鼠模型的基础上，进一步观察并明确醒脑益智剂对2型糖尿病性记忆功能和大脑胰岛素信号传导通路的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物 中药处方包括熟人参、地黄、川芎、粉葛、冰片、山药等，由成都中医药大学附属医院药剂科提供并制备。阳性对照品为马来酸罗格列酮片[商品名文迪雅，葛兰素史克(天津)有限公司，国药准字H20020475]，购于成都中医药大学附属医院。

1.2 试剂 Western Blot一抗购自Cellsignal公司，二抗购自北京博奥森生物公司。

1.3 动物 SPF级雄性10周龄健康C57BL小鼠16只，体重26～35 g；SPF级雄性10周龄健康KKAy小鼠80只，高脂高糖饲料(10%蔗糖、10%脂肪、基础饲料)喂养8周，血糖稳定后改为基础饲料喂养。以上动物及饲料均由中国医学科学院实验动物研究所提供[许可证号SCXK(京)2009-0004]。实验中动物自由摄食及饮水，取材前禁食12 h，温度(23±2)℃，相对湿度26%～29%。

1.4 仪器 One-Touch-II快速血糖仪及血糖试纸(美国强生公司)；显微镜(日本奥林巴斯BX51T-PHD-J1)；多功能真彩色细胞图象分析管理系统(Image-Pro Plus，美国Media Cybernetics 公司)；医用X射线胶片(柯达公司，美国)。

1.5 方法

1.5.1 造模和分组 C57BL小鼠16只，由基础饲料喂养，为正常对照组。Kkay小鼠80只，高糖高脂饲料喂养6周后检测随机血糖≥13.9 mmol/L为造模成功，随机分为模型对照组、阳性对照组和联合给药高、中、低剂量组，每组16只。

1.5.2 给药 阳性组每天用马来酸罗格列酮片按小鼠体重(0.003 g/kg)灌胃，联合给药大、中、小剂量组每日分别用马来酸罗格列酮片(0.003 g/kg)和醒脑益智剂生药(3.6、7.2、14.4 g/kg)灌胃，正常组和模型组每天用等体积生理盐水灌胃，持续42 d。

1.5.3 Morris水迷宫实验 分组前及给药后各进行一次。前4天为隐藏平台实验，限定时间90 s，若小鼠找到平台，使之于平台休息30 s；如90 s未找到平台，将小鼠捞起并放于平台休息30 s，并将时间记录为90 s。第5天为空间搜索实验，撤除平台，记录小鼠在90 s内第1次找到平台区的时间及找到平台的次数。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。

1.5.4 取材及标本制作

1.5.4.1 免疫组化样本 水迷宫试验结束后，抽签法每组选取8只小鼠，0.1% DCPC(0.1%去乙酰头孢菌素C)溶液处理并高压蒸汽消毒相关手术器械，按小鼠体重3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，生理盐水经左心室灌注后取全脑，4 ℃4%多聚甲醛固定24 h，取包括海马、大脑额叶皮质进行脱水、透明、浸蜡、包埋后连续冠状切片。

1.5.4.2 Western blotting样本 水迷宫试验结束后，抽签法每组选取8只小鼠， 3.5%水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉后无菌操作开颅取海马、大脑额叶皮质，匀浆后取上清液制备Western Blotting样本。

1.5.5 检测方法

1.5.5.1 每周1次断尾取血法监测血糖。

1.5.5.2 免疫组化方法 检测小鼠海马组织中PI-3K/Akt蛋白活性。先采用100倍显微镜观察小鼠大脑海马区，每个样本取6张相同部位的脑切片，然后在200倍光镜下选择5个相邻视野对阳性细胞(棕黄色胞浆)进行观察，最后采用Image-Pro Plus软件测定光密度值。

1.5.5.3 Western Blotting 检测小鼠海马组织中GSK-3β的活性、Tau蛋白总量及Tau蛋白磷酸化水平。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并分离蛋白，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上加一抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗，充分显影曝光并照相保存。

2 结果

2.1 体重和血糖 给药前Kkay小鼠体重(g)和血糖(mmol/L)均明显大于正常对照组C57BL小鼠体重(P<0.05)；给药后，正常组血糖水平变化不大，模型组血糖水平明显升高并高于其他各组，差异有统计学意义(P<0.05)。相较于正常组C57BL小鼠，转基因KKay小鼠养至第18周龄时即已出现轻度记忆障碍，并随时间推移、血糖升高而逐渐加重且波动不大，说明其作为2型糖尿病性记忆障碍模型已成熟稳定。见表1。

组别剂量/g/kg体重/g血糖/mmol/L给药前正常组-25.64±1.28 7.55±0.67 给药前KKay组-37.93±5.03# 20.81±3.37#给药后正常组-28.03±1.328.03±1.17△给药后模型组-39.18±2.23△24.32±3.89△给药后阳性组0.003 39.09±1.76△14.87±3.26∗△□给药后联合给药大剂量组0.06+0.00339.77±3.48△15.98±4.95∗△□给药后联合给药中剂量组0.03+0.00338.72±1.48△13.85±4.15∗△□给药后联合给药小剂量组0.015+0.00339.38±2.59△14.76±4.03∗△□

注：与给药前比较，*P<0.01；给药前与正常组比较，#P<0.05；给药后与正常组比较，△P<0.05；给药后与模型组比较,□P<0.05。

2.2 Morris水迷宫实验结果 给药后潜伏期比较，联合给药组和正常组第5天比第1天明显缩短，且明显小于模型组和阳性组；平台象限概率比较，联合给药组和正常组明显大于模型组和阳性组。差异均有统计学意义(P<0.05)。说明在使用罗格列酮改善胰岛素抵抗的基础上，醒脑益智剂可有效改善2型糖尿病小鼠的学习和记忆功能。见表2。

组别剂量/g·kg-1第1天潜伏期/s 第5天潜伏期/s 平台象限概率正常组-64.88±29.03∗58.19±25∗1.711∗模型组- 86±7.4775.93±20.620.38阳性组0.00385.53±8.7167.53±32.560.75联合给药大剂量组0.06+0.00374.37±20.23∗56.13±24.11∗1.573∗联合给药中剂量组0.03+0.00370.14±13.42∗51.41±18.38∗1.164∗联合给药小剂量组0.015+0.00380.25±15.23∗59.14±19.62∗1.353∗

注：与模型组比较，*P<0.05。

2.3 Western blotting实验结果 各组小鼠大脑海马中Tau蛋白总量差异不大。与模型组相比，正常组和联合给药组在Ser396位点上Tau蛋白磷酸化水平明显偏低，GSK-3β活性明显偏高，差异均有统计学意义(P<0.05)。Tau蛋白的过度磷酸化是2型糖尿病性记忆障碍重要的病理改变[8]，而GSK-3β活性升高是其主要原因。在改善胰岛素抵抗的基础上，醒脑益智剂可以有效降低GSK-3β活性并纠正Tau过度磷酸化水平。见表3。

表3 醒脑益智剂对海马内Tau、P-tau、GSK-3β及Ins R的影响 (n=8)

注：与模型组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.01。

2.4 免疫组化结果 模型组和阳性组PI-3K/Akt染色阳性表达不明显，正常组PI-3K/Akt染色阳性表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)，其主要表现为胞浆甚至细胞核呈黄褐色；与模型组和阳性组相比较，联合给药组PI-3K/Akt阳性细胞染色强度及阳性细胞分级均明显高于模型组和阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明醒脑益智剂能有效增强海马中PI-3K活性表达，而PI-3K活性的异常降低是引起GSK-3β活性升高和Tau过度磷酸化的关键因素。见表4。

表4 阳性细胞记数及免疫组化评分(5个视野)

注：评分标准： A为阳性细胞数分级0%～1%=0；1%～10%=1；10%～50%=2；50%～80%=3；80%～100%=4。B为阳性细胞显色强度分级0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)IHS=A×B。与模型组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.01。

3 讨论

脑内胰岛素功能复杂，其水平异常是促使记忆障碍发生的重要原因[8-12]。2型糖尿病是引发痴呆的重要因子之一，其可能的发病机制为大脑皮质及海马中存在PI-3K活性的降低、GSK-3β活性增高和Tau蛋白的过度磷酸化[8]，即胰岛素抵抗产生的信号传导障碍[9]。胰岛素信号系统功能低下时，会导致下游途径中磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)下降，从而导致Tau蛋白磷酸化的主要糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性增高[13-14]。因此，研究不同的胰岛素水平对PI-3K活性以及Tau蛋白过度磷酸化程度的影响，从分子水平上解释糖尿病与记忆障碍的关系及致病机制，并在组织细胞凋亡的同时预防和延缓神经细胞的退行性变方面都具有重要的意义[15]。

在临床上，张发荣教授以脑为轴心的“胰(脾)-脑-肾轴”的消渴呆病病机学说为基础，广泛运用补肾醒脑法治疗老年性痴呆(包括血管性痴呆)，取得较好疗效[16]。《灵枢·海论》云：“脑为髓之海，诸髓皆属于脑”。肾主藏精，为先天之本，是脑髓生成的物质基础，故有“肾生脑”之说。消渴日久，阴虚燥热，灼精耗液，脾肾亏耗，损及脑髓。在消渴呆病的发病环节中，根源为脑髓空虚，本质是肾精亏虚，始动因子为胰(脾)。治疗以补肾醒脑为根本大法，在控制血糖的基础上，以阻止智能衰减为最终目标，在《备急千金要方》所载开心散及张锡纯《医学衷中参西录》所载滋脺饮的基础上，结合多年临床实践，形成了醒脑益智剂。

在临床观察研究的基础上，研究在胰岛素抵抗状态下动物模型的记忆功能及海马PI-3K、GSK-3β的活性和Tau蛋白过度磷酸化的修饰水平发现，醒脑益智剂可有效提高2型糖尿病性记忆障碍小鼠的学习、记忆能力，增强大脑皮质及海马组织中PI-3K表达，降低GSK-3β活性，纠正Tau蛋白的过度磷酸化，改善大脑组织中胰岛素信号传导通路，这也为祖国医学进一步防治糖尿病性记忆障碍提供了理论依据。

[1]向田善之，廖宏.老年糖尿病的认知功能障碍[J].日本医学介绍，2007，28(9)：45.

[2]Aye Aye Myint，Kyaw Soe Win，Zaw Aung．Alzheimer's disease and type 2 diabetes mellitus: Risk factors and effectiveness of antidiabetic agents in treatment of Alzheimer’s disease[J]．Science J Clin Med，2013，2(3):114．

[3]Okereke OI，Kang JH，Cook NR，et a1．Type 2 diabetes mellitus and cognitive decline in two large cohorts of community-dwelling older adults[J]．J Am Geriatr Soc，2008，56(6)：1028-1036．

[4]Logroscino G，Kang JH，Grodstein F．Prospective study of type 2 diabetes and cognitive decline in women aged 70-81 years[J]．Br Med J，2004，328(7439)：548-555．

[5]王四平,王文智,李士懋.试论痰瘀是血管性痴呆的基本病机[J].中国中医基础医学杂志,2004,10(10):721-722.

[6]董桂英,赵世珂,郭立华.补肾活血法治疗老年期痴呆临床观察[J].中医药研究，1997，13(5)：13-14.

[7]Iqbal K, Alonso Adel C, Chen S, et al. Tau pathology in Alzheimer disease and other tauopathies[J]. Biochim Biophys Acta，2005，1739(2)：198-210.

[8]Deng Yanqiu, Li Bin, Liu Ying，et al. Dysregulation of insulin signaling, glucose transporters, O-GlcNAcylation, and phosphorylation of tau and neurofilaments in the brain: Implication for Alzheimer's disease[J]. The American Journal of Pathology, 2009, 175 (5):2089-98.

[9]Candeias E, Duarte Al, Carvalho C, et al. The impairment of insulin signaling in Alzheimer's disease[J]. IUBMB Life, 2012, 64 (12):951-957.

[10]郭蕾蕾,田国庆.胰岛素及胰岛素抵抗与糖尿病认知功能障碍[J].中国康复理论与实践, 2012,18(05): 433-435.

[11]Pedersen WA，Flynn ER. Insulin resistance contributes to aberrant stress responses in the Tg 2576 mouse model of Alzheimer's disease[J].Neurobiol Dis，2004，17(3)：500-506.

[12]曲梅花，房春燕，张秀荣，等.2 型糖尿病与轻度认知障碍[J]．生物化学与生物物理进展,2012，39(8) : 791．

[13]Kaidanovich O，Eldar-Finkelman H. The role of glycogen synthase kinase-3 in insulin resistance and type2 diabetes[J]. Expert Op in Ther Tar-gets，2002，6：555.

[14]Terwel D，Muyllaert D，Dewachter I，et al． Amyloid activates GSK-3β to aggravate neuronal tauopathy in bigenic mice[J]． Am J Pathol,2008,172( 3)：786．

[15]毛黎黎,高晓斐,孙子微.人参皂苷Rb1和罗格列酮联合用药对2型糖尿病痴呆小鼠记忆功能的影响及机制[J].中国实验方剂学，2014，(24)：130-133.

[16]岳仁宋,张发荣,龚光明.糖尿病性认知功能障碍中医认识新视角——“胰(脾)-脑-肾轴”消渴呆病病机学说的建立[J].四川中医,2009,27(1):28-29.