基于反转录环介导等温扩增技术检测大肠杆菌O157

梁玉林 刘秀 周鹏飞 周振森 尹建军

（中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

大肠杆菌是人肠道中正常的革兰氏阴性菌，大多数大肠杆菌没有致病性。正常情况下这些细菌寄生在人的消化道中，并随粪便排出体外，因此大肠杆菌广泛存在水和土壤中［1-4］。如果人体免疫机能降低或者大肠杆菌入侵肠道外组织时，它们会成为条件致病菌从而引起人类疾病。根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）、肠出血性大肠杆菌（Enterohernorrhage Escherichia coli，EHEC）和肠黏附性大肠杆菌（Enteroadhesive Escherichia coli，EAEC）。肠出血性大肠杆菌主要包括O157、O26、O111和O104等几种血清型［5-7］。其中大肠杆菌O157是最主要的食源性致病菌之一，它除了能引起腹泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症（Hemolytic uremic syndrome，HUS）、血栓性血小板减少性紫癜（Thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）等并发症，后者病情严重，病死率高［8］。感染性腹泻是近年新发现的危害严重的肠道传染病。自1982年美国首次发现该病以来，在许多国家相继爆发和流行，其流行已成为全球性公共卫生问题之一［9］。

大肠杆菌O157检测方法主要是传统培养分离法［10］，分离出的病原菌还要对其进一步分型确认。该方法费时费力，当某种致病菌的检测需要快速出具结果时，传统培养分离法的严重滞后性就会凸显出来。近年来，致病菌分子检测方法层出不穷，分子检测不但省时省力而且具有比较高的特异性和灵敏度［11］。张微等［12］利用荧光定量PCR技术，建立快速、有效的检测乳中大肠杆菌O157的方法。尽管该方法操作简单，灵敏度达到67 CFU/mL，但需要专业人员和高精密的仪器设备，不易在基层推广。因此，需要开发一种快速、灵敏、准确的方法来现场检测大肠杆菌O157。

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是一种新的核酸扩增方法［13］，其扩增过程中的DNA聚合酶采用具有链置换活性的DNA聚合酶，整个DNA扩增是在60-65℃恒温条件下进行的快速扩增反应。由于DNA双链结构稳定，在死菌中能长时间存在，以DNA为检测模板容易检出死菌中残留的核酸而出现假阳性的后果，不能体现样本中的活菌数量［14］。RNA易降解，不能长时间存在于死菌当中，反转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）技术是以RNA为检测模板的扩增反应［15-16］，除了具有常规LAMP的优势外，还具有有效区分死菌和活菌的独特优势。本研究以大肠杆菌O157的特异性保守基因序列设计多组引物并筛选，构建基于RNA为检测模板的RT-LAMP技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 大肠杆菌O157等26株细菌如表1所示；溶菌酶，天根生物科技公司；RNeasy Mini kit，QIAgen 公司；Isothermal Master Mix（IMM），英国OptiGene Limited公司；焦炭酸二乙酯（DEPC），中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；平板计数琼脂（PCA），北京路桥技术股份有限公司；One Step PrimeScript RT-PCR kit，宝生物工程（大连）有限公司。

表1 RT-LAMP反应特异性

1.1.2 仪器与设备 微量移液器，德国Eppendorf公司；高压灭菌锅（SX-700），日本Tomy Digital Biology公司；精密天平（CPA323S），德国Sartorius公司；超纯水仪（Mili-Q Advantage A10），德国默克公司；离心机（5804R型，5424型），德国Eppendorf公司；超微量核酸蛋白分析仪（Biodrop），英国柏点公司；GenieⅢ，英国OptiGene Limited公司；生物安全柜，新加坡Esco公司。ABI 7900荧光PCR仪，美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank中的rfbE基因（GenBank Accession S83460.1）的序列，利用LAMP Primer Explorer 4在线软件（http：//primer explorer.jp/elamp4.0.0/index.htm l）设计8组引物，每组引物分别包括外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物LoopF、LoopB。将8组引物进行RT-LAMP实验，选取稳定性强、扩增时间快和荧光值相对较高的引物组进行下一步试验，每组引物平行进行3次RTLAMP测试。

1.2.2 纯培养细菌的RNA提取 在平板上取大肠杆菌O157单菌落接入LB液体培养基中，培养12 h到对数期。取1 mL菌液5 000×g离心10 min，轻轻倒掉液体。向沉淀加入10 μL蛋白酶K，100 μL TE（含终浓度15 mg/mL溶菌酶），充分混匀沉淀，在室温下反应30 min，接下步骤严格按照RNeasy Mini kit操作步骤提取。

1.2.3 rRT-PCR和RT-LAMP反应 rRT-PCR扩增引 物 rfbE-F ：5′-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTG-3′，rfbE-R ：5′-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3′，rfbE-BJP ：5′-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCT GG-3′。按照 One Step PrimeScript RT-PCR kit操作步骤进行反转录和进一步核酸扩增反应。扩增条件为50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15s，60℃ 1 min，共45个循环。对于Ct值≤40的扩增结果判定为阳性。

经优化后在 12.5 μL 体系中，包括 7.5 μL Mix、2.5 μL混合引物（外引物、内引物和环引物含量分别为2.5 pmol、10 pmol和 5 pmol）、1.5 μL 模 板。RT-LAMP反应温度65℃，反应时间30-60 min。

1.2.4 大肠杆菌O157死菌中RNA降解情况 为验证大肠杆菌O157死菌中RNA降解情况，避免死菌中DNA对RT-LAMP检测结果的干扰。我们选取104、103、102、101CFU/mL 四个菌液浓度。121℃下20 min高压蒸汽灭菌，放置一段时间，模拟死菌状态，对死菌进行平板培养，验证是否灭菌完全。分别对灭菌前后各浓度梯度的大肠杆菌O157菌液进行RNA提取，并进行RT-LAMP反应。

1.2.5 RT-LAMP反应的特异性和灵敏度 提取大肠杆菌O157等26株细菌RNA，并以RNA为检测模板进行RT-LAMP反应验证该方法的特异性。

将提取的大肠杆菌O157原菌液总RNA测定浓度后，对总RNA进行稀释，最后选取3 fg、30 fg、300 fg、3 pg、30 pg、300 pg、3 ng/μL 共 7 个 浓 度梯度，从各浓度梯度各取1.5 μL作为检测样本进行RT-LAMP反应检测纯培养大肠杆菌O157灵敏度。

1.2.6 rRT-PCR和RT-LAMP反应在人工污染脱脂乳中的灵敏度检测 为保证检测结果的准确性，经国标GB/T4789.2-2016方法证实试验所用脱脂乳中不含大肠杆菌O157，取25 g脱脂乳置于225 mL灭菌生理盐水中样品。取新鲜培养的12 h细菌，用生理盐水充分洗涤培养基，10倍梯度系列稀释，取各稀释度菌液1 mL加入脱脂乳匀浆中，制备人工污染脱脂乳匀浆，使人工污染脱脂乳匀浆中大肠杆菌O157含量达到10-1-105CFU/mL，充分混合，作为人工污染脱脂乳样品。

取各菌液浓度的人工污染脱脂乳样品1 mL，提取人工污染脱脂乳样品中的RNA，同时取不加大肠杆菌O157的脱脂乳样品1 mL作为阴性对照平行进行RNA提取。以提取的RNA为检测模板分别进行rRT-PCR和RT-LAMP反应，比较两种方法的检测灵敏度。每个浓度的RNA模板分别进行5次独立rRTPCR和RT-LAMP试验，当某个浓度梯度的RNA模板的5次试验中有1次无法观察到扩增曲线，该浓度的上一稀释度才能被认定为最低检测灵敏度。

2 结果

2.1 八组大肠杆菌O157引物筛选

根据引物间距离、GC含量、引物序列Tm值、引物末端稳定性和二级结构5个因素，实验共设计了8组LAMP引物。如图1在整个实验室不含大肠杆菌O157核酸样品情况下，对8组引物进行RTLAMP扩增反应发现3号、4号和8号引物均发生扩增反应，可以断定该扩增反应是非特异性的，可能是由于引物间的碱基互补配对引起的扩增反应。如图2在含有大肠杆菌O157核酸样品情况下，对8组引物进行RT-LAMP扩增反应，2号引物出现扩增曲线的时间最短。综合3次测试结果，2号引物具有较高的稳定性，其在反应时间上明显比其它引物组都快且荧光值相对较好。选取2号引物作为RT-LAMP反应引物进行下一步实验，2号引物序列如表2。

图1 大肠杆菌O157引物筛选（不含检测模板）

图2 大肠杆菌O157引物筛选（含检测模板）

2.2 大肠杆菌O157死菌中RNA降解情况

在121℃下20 min高压蒸汽灭菌处理的大肠杆菌O157，经平板培养观察未发现形成菌落，灭菌后的细菌均无繁殖能力。对灭菌前后不同浓度的大肠杆菌O157菌液进行RNA提取，并经RT-LAMP检测。图3为灭菌前大肠杆菌O157 RT-LAMP扩增反应，可以看出提取101CFU/mL菌液RNA进行RTLAMP反应仍能出现荧光扩增，说明反应体系中存在RNA。图4为灭菌后大肠杆菌O157 RT-LAMP扩增反应，可以得出各菌液浓度的核酸提取物中未含有RNA。结合图3和图4进一步证实104CFU/mL及其以下死菌菌液中RNA降解完全，以RNA为检测模板进行RT-LAMP反应可以鉴别死活菌。

表2 大肠杆菌O157靶基因引物序列

图3 活菌RNA检测

图4 死菌RNA检测

2.3 RT-LAMP反应特异性和灵敏度

本研究共对26株细菌进行RT-LAMP试验，其中只有2株大肠杆菌O157产生特异性扩增反应，其他大肠杆菌血清型和非大肠杆菌菌株均未产生特异性扩增反应（表1）。说明筛选到的引物具有较高的特异性，只能特异性检出大肠杆菌O157。

对提取的纯培养大肠杆菌O157的总RNA进行10倍梯度稀释，验证建立的方法对纯培养大肠杆菌O157的检测灵敏度。结果如图5所示，当总RNA稀释到30 fg/μL时，RT-LAMP反应仍能产生扩增曲线，而继续稀释核酸将不会产生扩增曲线，表明纯培养大肠杆菌O157检测灵敏度达到30 fg/μL。

图5 RT-LAMP反应灵敏度

2.4 rRT-PCR和RT-LAMP反应在人工污染脱脂乳中的灵敏度检测

将提取的人工污染脱脂乳样品RNA溶解到50 μL不含RNase的无菌水中，取其中1.5 μL作模板，分别进行rRT-PCR和RT-LAMP反应。同时取1 mL各浓度梯度的人工污染脱脂乳样品进行平板菌落计数，记录各浓度梯度人工污染脱脂乳样品中大肠杆菌O157的准确含量。从图6可以看出rRT-PCR检测灵敏度达到20 CFU/mL，换算成固体脱脂乳污染样品检测灵敏度为200 CFU/g。从图7可以得出RTLAMP反应灵敏度达到2 CFU/mL，换算成固体脱脂乳污染样品检测灵敏度为20 CFU/g。所建立的RTLAMP方法灵敏度高，比rRT-PCR反应灵敏度高10倍。

图6 人工污染脱脂乳rRT-PCR反应灵敏度

图7 人工污染脱脂乳RT-LAMP反应灵敏度

3 讨论

目前国内外文献报道的大肠杆菌O157的LAMP检测方法多以stex、eae、wzy和rfbE等基因作为特异性扩增靶基因，其中stex是编码志贺毒素毒力因子基因［17-19］，但有些大肠杆菌O157缺失stx基因，以stex基因序列设计LAMP引物可能不会扩增出目的基因条带进而造成假阴性的问题。wzy是编码O抗原聚合酶的基因［20］，eae是编码紧密黏附素的基因［21］，然而eae和wzy基因除了存在于大肠杆菌O157外，也少量存在于一些肠科细菌，以这两种基因序列设计的LAMP引物可能会检测出大肠杆菌O157以外的肠科细菌，进而造成假阳性的后果。研究表明大肠杆菌的rfb基因作为靶基因具有很好的保守性［22］，大肠杆菌rfb基因是O抗原的编码基因，不同序列的rfb基因编码产生不同的O抗原，其中大肠杆菌O157的O抗原特异性编码基因为rfbE基因［23］。本研究以rfbE基因设计引物，以RNA为检测模板进行RT-LAMP反应，结果能够证实所检测的大肠杆菌O157是否处于活的增殖状态［24-26］。此外实验依靠GenieⅢ平台使得反转录过程和扩增过程同时进行，大大降低了反应时间，有利于现场快速检测工作的开展。

在人工污染脱脂乳样品实验中，当样品中大肠杆菌O157浓度稀释到2 CFU/mL时，建立的实时荧光RT-LAMP方法每次均能特异性检出，当菌液继续稀释到更低时，该方法有时不能检出。对于细菌含量很少的样品，尤其是量少也易致病的大肠杆菌O157，如果不经过前增菌很有可能造成漏检的严重后果，为保证结果的可靠性可以适当加上前增菌等步骤。因为受大肠杆菌O157污染的食品种类很多，实验只进行了人工污染脱脂乳实验，后期需要扩大人工污染食品种类，验证方法的可靠性。

4 结论

本研究对大肠杆菌O157设计多组LAMP引物并筛选，确定反应体系配比，从而建立了检测大肠杆菌O157的实时荧光RT-LAMP方法。该方法只特异性检出大肠杆菌O157，其他大肠杆菌血清型和非大肠杆菌菌株均未产生特异性扩增反应，对固体脱脂乳污染样品检测灵敏度达到20 CFU/g。

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