化州柚SCoT-PCR反应体系的优化及分类鉴别研究

王浩涵， 杨洁清， 欧阳小健， 孙杨杨， 黄海波

(广州中医药大学，广东广州 510006)

化橘红药用历史悠久，疗效显著，具有理气宽中、燥湿化痰等功效，用于治疗呕恶痞闷、咳嗽痰多等病症，为广东十大南药之一，主要产于广东化州。化橘红基原植物为芸香科柑橘属化州柚(CitrusmaximaTomentosa)或柚(CitrusmaximaL. Osbeck)及其栽培变种[1]，前者别称毛橘红，后者别称光橘红。在目前的研究中普遍认为毛橘红的质量优于光橘红[2-3]，而光橘红产量大，成本低，品种来源广泛，容易与毛橘红混淆，已经对毛橘红市场造成了冲击。目前市场中的毛橘红基原也较复杂，仅文献中提及的就有凤尾、假西洋、密叶、黄龙、金钱脐等十余个品种，并且在植物形态及质量上均有差异[4-5]。大量柚类及化州柚品种都可能被用作化橘红药材，而其在苗期难以区分，因此，开发一种可靠有效的方法有助于准确鉴别化橘红基原植物及其种苗。

目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism，简称SCoT)是Collard等于2009年在水稻上提出的一种新型分子标记[6]。该标记是针对ATG起始密码子侧翼的保守序列设计的单引物，其扩增的片段多偏向候选功能基因，目前在化州柚的种质资源研究中尚未见报道。本研究通过正交试验设计构建SCoT-PCR的最佳反应体系，筛选引物并优化其最佳退火温度，对不同品种化州柚及柚类进行遗传多态性分析，构建其非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，简称UPGMA)聚类树，以期为化橘红基原植物的鉴别分类提供一种有效可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料均采集自植株顶芽往下第3～5张幼嫩叶片，用吸水纸吸干表面水分后用塑封袋封口，2 d内放入-80 ℃冰箱保存备用。本试验于2017年4—11月在广州中医药大学创新中药研发公共服务平台分子生物学实验室进行，样品由广州中医药大学中药鉴定教研室主任黄海波副教授鉴定，凭证标本保存于广州中医药大学，样品详细信息见表1。

1.2 试验仪器和试剂

OSE-Y20电动研磨仪，购自天根生化科技(北京)有限公司；Centrifuge 5424R冷冻离心机，购自Eppendorf公司；NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计、Arktik PCR仪，购自Thermo公司；Power Pac Basic电泳仪，购自Bio-Rad公司；Tanon-2500凝胶成像系统，购自上海天能科技有限公司。

dNTPs、Mg2+、10×ExTaqBuffer(无Mg2+)、ExTaqDNA聚合酶、琼脂糖、DL5000 maker、Goldview Ⅰ，购自TaKaRa公司；β-巯基乙醇、Tris平衡酚、Tris-乙酸电泳缓冲液(50×TAE)，购自广州瑞舒生物科技有限公司；DP305植物基因组DNA提取试剂盒、6×上样缓冲液(loading buffer)，购自天根生化科技有限公司；其余均为国产分析纯试剂。36条SCoT引物序列均参照文献[6]，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.3 DNA提取

称取0.1 g样品置于经预冷的1.5 mL离心管中，加入液氮使叶片充分冷冻，用研磨仪迅速将其研成粉末。试验步骤参照天根DP305植物基因组DNA提取试剂盒说明书进行，为提取到浓度更好的DNA，增加水浴时间至1 h。

1.4 DNA质量检测

采用琼脂糖凝胶电泳检测总DNA降解情况。取1 μL DNA，在超微量分光光度计下检测吸光度以测定其浓度及纯度，并将所有样品稀释至50 ng/μL。

表1 化州柚及其近缘品种样品信息

注：*表示未查找到拉丁名。

1.5 SCoT-PCR反应体系正交试验设计

引物选择S32，样品采用A6化州橘红研究所的化州柚(凤尾)，对PCR体系的5个主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板的用量进行优化，每个影响因素设置5个水平(表2)。正交试验共25组，每组重复3次，反应采用20 μL体系，每个体系添加1×PCR buffer，余量以ddH2O补足。

1.6 PCR扩增及电泳检测

PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，49 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，36个循环；72 ℃延伸 10 min。取5 μL扩增产物与1 μL loading buffer混匀，在GoldView 染色后的1.5%琼脂糖凝胶上电泳， 缓冲液为1×TAE，电压为120 V，时间为1 h，最后于凝胶成像系统中拍照保存。

表2 L25(56)正交因素水平设计

1.7 引物筛选及退火温度优化

采用优化后的最佳反应体系对6个样品(A4吴川正毛、A8清湖假西洋、A9大岭假西洋、A11广中医正毛、A20红玉香柚、A25柠檬)筛选所有引物，选择条带清晰、间距明显且多态性好的引物进行退火温度筛选。在ArkTik PCR仪上设定温度范围46～55 ℃，在自动生成的12个梯度温度中选择9个温度(46.0、47.4、48.4、49.6、51.1、52.5、53.5、54.3、55.0 ℃)对条带清晰、多态性好的引物进行优化。

1.8 数据处理及统计

1.8.1 反应体系正交分析 对正交设计的凝胶图像采用姜小凤等的方法[7-8]综合打分。按条带的清晰度、亮度及数量从低到高赋值1～25分，对3次重复进行3次独立计分。依据计分结果进行直观分析，假设各因素之间不存在交互作用，计算各因素在各水平下的平均分值，以反映因素的各个水平对体系的影响程度。

1.8.2 UPGMA聚类分析 对得到的SCoT电泳条带图谱应用Tanon-2500系统GIS软件进行分析，对图谱中同一迁移率位置清晰出现的条带赋值“1”，无条带的赋值“0”，条带模糊或不清晰的不予统计，构建“0/1”表。对所得的“0/1”表应用NTSYS-pc2.10e软件计算其遗传距离，对计算结果采用UPGMA算法聚类，对聚类结果构建SAHN树状图。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

2.1.1 电泳检测结果 由图1可知，所有样品均呈现出1条清晰的条带，无拖尾现象，且无蛋白污染，表明提取到的DNA质量较好，适用于后续研究。

2.1.2 纯度与浓度检测 提取的所有样品的DNA浓度范围在70～187 ng/μL，D260 nm/D280 nm值均在1.8左右，说明试剂盒法能在柚类植物中提取到质量优、纯度高的DNA，符合试验要求。

2.2 PCR正交设计结果

对凝胶图谱(图2)按条带清晰程度及数量打分，3次独立打分的平均分依次为4.00、5.33、3.67、0、0、7.67、8.67、4.67、6.37、2.00、7.00、10.00、16.33、16.67、11.67、12.00、9.00、13.67、14.67、10.33、2.67、9.67、19.33、25.00、22.33分。依据直观分析的结果(表3)，按极差R值的大小各因素对反应体系的影响程度依次为Mg2+浓度>dNTPs浓度>引物浓度>Taq酶用量>DNA用量，其中Mg2+浓度对反应结果的影响最大，而DNA浓度则对反应结果影响最小。根据均值K，各因素各水平下均值最高的为最优用量，则得到的最优反应体系为3 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、0.75 UTaq酶、0.4 μmol/L引物、50 ng DNA。

2.3 引物筛选及退火温度优化

依据优化的最佳反应体系，以差距较大的6个样品(A4吴川正毛、A8清湖假西洋、A9大岭假西洋、A11广中医正毛、A20红玉香柚、A25柠檬)DNA为模板，对36条引物进行筛选，得到6条(S2、S14、S15、S20、S30、S32)条带清晰、多态性高的引物，部分引物筛选结果见图3。对筛选到的6条引物逐一进行退火温度筛选，在设置的9个温度条件下选择条带清晰且多态性高的作为最适退火温度。部分退火温度筛选结果见图4，最终得到各引物的最适退火温度(表4)。

2.4 SCoT标记的多态性分析

利用筛选出的6条引物以最优退火温度条件对25份化州柚及近缘种样品(A25柠檬样品不计入多态性结果)进行扩增，共扩增出94条条带，其中69条具有多态性(表4)。筛选出的每条SCoT引物平均可扩增出条带15.67条，多态性比例55.56%～85.00%，平均多态性73.4%，表明SCoT标记在化州柚种质中扩增效率高， 化州柚及其近缘种遗传多态性较丰富(图5)。

表3 正交设计直观分析结果

2.5 SCoT标记的聚类分析

将所有引物在25份样品得到的结果转化为“0/1”表，利用NTSYS计算其相似系数，25份试材的遗传相似系数分布在0.600～0.992之间，以黑、灰、白3种颜色分别代表最低值、中间值、最高值，构建遗传相似系数热图(图6)。对图6直观分析可知，图中数据颜色大多数较浅，表明25份试材之间相似度较高。

用UPGMA算法构建树状图(图7)，在相似系数为0.65左右时可将柠檬(A25)与柚类样品区分，在相似系数为0.79左右时可将柚类样品分为2个类群。所有的化州柚(A1～A11)及1份沙田柚(A12)样品为第1个类群，在第1个类群中不同的化州柚品种没有各自聚为一支，且与1份沙田柚(A12)同聚为一支；第2个类群中先是将沙田柚(A13、A14)聚为一支，另一分支中云南瑞丽的本地实生种红玉香柚(A20)独自聚为一支，不同品种和采集地的5份琯溪蜜柚(A15～A19)先聚为一支后与云南芒市的本地柚聚为一支，瑞丽的水晶柚(A23)和优选品种大富五号(A22)聚为一支后与光青(A24)聚为一支。

3 结论与讨论

本研究通过正交设计优化了SCoT-PCR反应体系，从36条引物中筛选出6条并优化了其退火温度，最终扩增得到了55.56%～85.00%的多态比例，构建了适用于化州柚及其近缘种的SCoT分子标记体系。通过UPGMA聚类分析发现，化州柚能够较好地与琯溪蜜柚、水晶柚等其他柚类品种区分开，但可能由于嫁接因素，沙田柚显示出与化州柚较近的亲缘关系。不同品种的化州柚没有很好地聚在一起，也表现出一定的差异，且这种差异不是由产地因素引起的，可能存在更多的化州柚品种。凤尾与密叶亲缘关系较近而与假西洋较远，正毛则在凤尾和假西洋中均有分布， 提示正毛和副毛的区分可能是因商品等级而非品种差异。

目前在化橘红种质资源的研究中，已有多种分子标记显示出较低的多态性，且不同品种的化州柚相似度高、分类困难。SCoT分子标记较好地揭示了25份化州柚及其近缘种的遗传差异，并且扩增得到的片段多为候选功能基因，能够进行更进一步的研究，是适用于化州柚种质资源分析的有效手段。

SCoT分子标记技术对PCR反应体系的要求较高[9]，在本试验中发现，体系内各因素浓度微小的变动都有可能影响试验结果，因此对SCoT-PCR反应体系的优化十分必要。在化州柚种质资源的SCoT标记研究中，本试验取得了55.56%～85.00%的多态性比例。而邓锋等利用ISSR标记在化橘红种质资源研究中则获得的多态性不够明显[10]，张秋镇等利用AFLP标记也仅取得了5.21%的多态性[11]。从对多态性的揭示效率来看，SCoT标记可作为研究化州柚种质资源的一种有效手段。

表4 SCOT引物筛选优化结果

本试验所构建的UPGMA树状图能够将化州柚样品与其他柚类样品分开，但有1份沙田柚样品与化州柚聚类关系较近，这可能是如今化州柚多嫁接于沙田柚上培育的结果。陈晓颍等研究发现，化州柚与沙田柚在ITS1序列上仅有2个碱基的差异[12]，谭婉菁等研究也发现，正毛和沙田柚的相似程度高，并且认为正毛和沙田柚有一定的关系[13]。而另外的2份沙田柚样品均来自海南琼海且聚为一支，它们在当地有15年以上的树龄，由于海南地理位置的特殊性，生长环境的差异可能造成了这2份沙田柚与广东沙田柚的差别。试验结果能够将对照品种柠檬与柚类分开，且柚类品种如化州柚和琯溪蜜柚都能够很好地聚类，体现出SCoT标记在柚类植物中分类鉴别的有效性和准确性。

针对不同品种化州柚的分析，本研究显示出以下几个特点：(1)同一品种的化州柚样品没有很好地聚为一支，但其聚类结果相对集中，凤尾与假西洋样品没有混在同一小分支的情况，且同一采集地的不同品种有区分(如江湖镇的凤尾和密叶)，同一品种采集地不同也能聚为一支(如广西和大岭村的假西洋)；(2)本试验中的假西洋样品能够聚为一类，而4个凤尾样品则相对分散，这可能由于凤尾是比较古老的品种，在长期繁衍的过程中，其后代发生变异的可能性较大[14]，赵俊生等利用单核苷酸多态性(SNP)标记对不同品种化州柚的基因分型研究中也表明化橘红种质资源可能存在更多的品系[15]；(3)笔者在化州实地采样中了解到密叶是相对较新的品种，并且可能由凤尾演化而来，而本试验结果也印证了这一观点；(4)本研究中正毛样品被分为2支， 分别与凤尾和假西洋表现出较近的亲缘关系。正毛、副毛、光青是依据果实表面茸毛的多寡进行区分的，在早期是一种商品的分类方法，这种称谓一直沿用至今。而化州柚在长时间的繁衍下，已衍生出多个品种，正毛化橘红也可能来源于不同的品种。赵俊生等的SNP分型研究中发现，相同来源的正毛样品基因型不同，却分别与另一不同来源的正毛样品基因型相同[15]，庞一波的研究中也得到了相似的结论[16]。化州当地也有专家认为，正毛、副毛不应归为化州柚的不同品种而应作为不同的商品等级，同一植株在不同环境及管理条件下都有可能呈现出果实茸毛的多寡，并且化州柚果实存在越成熟毛越少的特性[17]，因此同一植株的果实也可能出现“正毛”或“副毛”的特性。

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