26份海州常山种质资源遗传多样性的AFLP分析

谢福春， 曾现艳， 程 瑶， 张艳君， 秦 栋， 王华田

(1.东北农业大学园艺园林学院，黑龙江哈尔滨 150030； 2.烟台新海建筑设计有限责任公司，山东烟台 264000;3.哈尔滨理工大学荣成学院，山东荣成 264300； 4.山东农业大学林学院，山东泰安 271018)

海州常山(ClerodendrumtrichotomumThunb.)是马鞭草科(Verbenaceae)大青属(Clerodendrum)落叶小乔木或灌木，在我国华北、华东、中南和西南各省(区、市)均有分布，常见于山丘陵、荒坡沟谷等地[1]。海州常山具有花形别致，花、果观赏价值高且观赏期长的特点，被广泛应用于城市园林绿化中，同时由于该树种具有较强的抗盐、抗旱、耐涝等特性，是干旱瘠薄荒山及矿区废弃地植被恢复与重建、城市废弃地绿化、盐碱地绿化的优良树种。目前对于海州常山的研究多集中在繁育技术、抗逆性机制、花粉活力的测定及植物化学成分分析等方面[2-6]，而对其遗传多样性的研究相对较少。

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，简称AFLP)分子标记技术是一项以PCR反应为基础的分子标记技术，具有DNA用量少、多态性水平高、检测位点多、分子识别率高等特点[7-9]，近年来被广泛应用于鸡冠花、银杏、珙桐和海棠等观赏植物的遗传多样性研究[10-13]。本研究采用DNA-AFLP分子标记技术，对来自我国15个省(区、市)26份种源的海州常山进行遗传多样性研究，从分子水平揭示我国海州常山种质资源的遗传多样性水平和遗传进化关系，为海州常山的良种选育和遗传变异性研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

根据中国数字植物标本馆、《中国植物志》及其他相关文献记载确定海州常山标本采集地点，结合标本采样地点的地理位置和主要气象因子(年均温、日照时数、无霜期、降水量)，对海州常山种源分布进行区域划分，根据种源区划确定15个省(区、市)，根据每个省(区、市)资源的分布情况，确定采集地点，共选取26个采集地点(表1)，所选采集地点基本覆盖了海州常山在国内的分布区域。采集的不同地区的海州常山种源种植于山东农业大学种质资源圃，本试验采集的幼嫩叶片均是来自不同地区的海州常山3年生萌蘖苗。

1.2 DNA提取

每个种源从5个单株中各取2张幼嫩叶片混合取样 50 mg，利用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[14]提取海州常山叶片基因组总DNA，采用紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量和浓度，将样品稀释到50 μg/mL，于-20 ℃保存备用。

1.3 AFLP分析

参照Vos等的方法[15]，用EcoRⅠ+MseⅠ内切酶组合对基因组DNA进行酶切，从64对AFLP引物中筛选出条带清晰、多态性高的8对引物组合(表2)。预扩增总反应体系：酶切连接产物2 μL，Pre-AMPmix 1 μL，dNTPs 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 U/μLTaq0.5 μL，ddH2O 18 μL，共 25 μL。预扩增PCR程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性 30 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸 5 min。将PCR产物稀释20倍后作为选择性扩增模板，选择性扩增体系同上。PCR扩增程序：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，1个循环，然后以每次循环复性温度逐级降低0.7 ℃的梯度继续进行12个循环，变性和延伸条件同上，最后以94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，23个循环结束。PCR产物经 95 ℃变性 10 min 后用4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染法检测。

表1 海州常山采样地概况

表2 海州常山荧光AFLP引物筛选中供试的64对引物组合

1.4 数据分析

用377DNA自动检测仪扫描电泳胶图，用Gene Scan3.1软件对电泳胶图进行数据提取，通过Binthere软件分析各片段大小。利用Excel 2007将原始数据中有带的换成“1”，无带的换成“0”，构建“01”矩阵。利用POPGENE version1.31软件计算遗传多样性参数：多态带数(AP)和多态带百分率(P)；观测等位基因数(Na)、观测的有效等位基因数(Ne)、香农信息指数(I)、Nei’s基因多样性(H)。用NTSYSpc-2.11F软件进行数据分析。对原始矩阵用Sim Qual程序求DICE相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵。用SHAN程序中的非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，简称UPGMA)方法进行聚类分析，并通过Treeplot模块生成聚类图(图1)。

2 结果与分析

2.1 AFLP扩增结果

从64对引物组合中筛选出8对谱带清晰、多态性高且稳定的引物组合，这8对引物扩增图谱显示电泳带数目丰富，分带清晰(图2)。扩增片段的大小在70～500 bp之间，且分布相对均匀。8对引物组合共扩增出1 042条条带，其中多态性条带1 030条，占比为的98.85%。不同引物组合扩增出的多态性条带总数范围在115～148条之间，平均为128.75条；不同引物组合平均多态性条带比例为98.87%(表3)。不同引物产生的条带数存在一定的差异，其中E-ACA/M-CAG引物产生的条带最多，为151条，而E-AGC/M-CAG引物产生的条带最少，为116条。引物组合E-AGC/M-CAG和E-AGG/M-CAA扩增出的位点全部具有多态性，而引物组合 E-ACA/M-CAG的多态性位点的比例最低，为98.01%。以上分析表明，所选择的引物在海州常山种源间表现了较高的多态性。

表3 AFLP选择性扩增引物产生的条带多态性

采用POPGENE软件对不同引物组合对海州常山的遗传多样性进行分析。由表4可知：26份海州常山种质资源平均观测等位基因数为1.562 5个，平均有效等位基因数为 1.226 0个，平均Nei’s基因多样性、平均香农信息指数分别为0.142 0、0.225 5，以上数据显示，我国海州常山的多态性丰富，种源间的遗传多样性较高，存在丰富的变异。

2.2 不同海州常山种质资源的遗传相似性系数分析

采用NTSYSpc 2.10软件计算种质间遗传相似系数(表5)，结果显示，来自不同地区的26份海州常山的遗传相似系数在0.285 1～0.690 9之间，平均为0.518 0。其中山东泰安马套村和泰安夏张镇2个种源间的相似系数最大(0.690 9)，甘肃天水和云南昭通间的相似系数最低(0.285 1)。据统计，遗传相似系数在0.400 0～0.600 0之间的占种源总数的81.58%；遗传相似系数小于0.400 0的占7.69%；遗传相似系数大于0.600 0的占10.46%。另外从相似系数矩阵可知：来自同一省份或者相近地域的种源之间相似系数较大，例如来自山东省、河南省、江苏省的种源之间相似系数偏高。由遗传相似系数分析可知，供试材料之间的遗传相似性与地理距离存在显著的相关性，地理距离越远，遗传相似性越小，遗传距离越大，基因间的交流越少。反之，遗传相似性越大，材料间的遗传距离越小，基因交流越频繁。

表4 基于不同引物组合的海州常山遗传多样性水平

注：同列数据后标有不同大写字母表示在0.01水平上差异显著。

2.3 不同海州常山种质资源的聚类分析

根据相似性系数进行UPGMA聚类分析，在相似系数为0.534处可以将所有种源海州常山划分为7类(图1)：第一类包括2个种源，分别为山西太原和甘肃天水，第二类陕西杨凌单独为一类，第三类包括19份种质资源，在相似性系数0.57处切割。可将第三类群划分为4个亚群(A、B、C、D)，A亚群包括11个种源，其中在11份种源中，山东的占有8份，其他3份分别为山东省周边省份；B亚区包括1份种源，为辽宁大连；C亚区包括3份种源，分别为安徽舒城、江苏连云港、江苏南京；D亚区包括4份种源，分别为湖北神农架、河南新县、河南西峡、浙江天目山。广西临桂县、云南昭通、重庆金佛山、贵州望谟这4个种源可能由于分别地处热带和亚热带的交界、热带、亚热带、亚热带，加上地理位置相差较大，在聚类图上分别单独聚为一类。

3 讨论

3.1 AFLP标记的检测有效性及海州常山的遗传多样性分析

在植物遗传多样性研究中AFLP标记技术已在农作物、花卉、树木等植物中广泛应用[16-18]。例如野生扁蓿豆[19]、鸡冠花[10]、枸杞[20]、紫椴[21]等植物遗传多样性的研究都采用AFLP标记技术。本研究筛选出8对AFLP引物对26份来自不同地理区域的海州常山进行扩增，共检测出1 042条带，其中多态性条带1 030条，多态性位点比例98.85%。另由多样性参数可知：Na为1.562 5个，Ne为1.226 0个，H、I分别为 0.142 0、0.225 5，这与紫椴、甘蔗[21-22]等作物的研究类似，表明26份海州常山种质间有丰富的遗传多样性，这为海州常山的资源开发利用奠定了基础。植物的遗传多样性水平与其生物学特性、环境、分布范围、花粉和种子传播方式等因素有关[23]，本试验中的26份种源遗传多样性丰富，可能是由于种源采自全国不同地区，这充分表明我国海州常山种质资源具有丰富的遗传基础。

3.2 国内主要分布区的海州常山亲缘关系分析

在来自不同地区的26份海州常山种质资源中，其相似系数在0.285 1～0.690 9之间，来自不同省份的海州常山种质资源间相似系数相对较小，这一趋势与对紫花苜蓿[24]、白花泡桐[25]、甘蔗[22]种质资源间遗传相似系数的分析相似，可知来自不同省(区、市)的海州常山种质资源间的亲缘关系相对较远，基因交流较少。聚类分析表明，划分类群与地理起源明显相关，例如来自山东、河南、江苏各地区的种源多数聚为一类或者聚为一亚类，而来自地理距离较大的广西临桂县、云南昭通、重庆金佛山、贵州望谟这4个种源各自单独聚为一类，表明这4个种源与其他材料间的亲缘关系相对较远，具有相对独立的遗传特性。亲本间的亲缘关系在很大程度上决定着后代群体的选择范围，通常认为2个亲本遗传差异越大，后代分离范围就越广泛，获得优良个体的机会也就越多。从聚类分析可知，地理位置分布差异较大的几个海州常山种源可考虑作为杂交亲本，为海州常山今后育种提供科学依据。

由于对海州常山种质资源的多样性研究刚刚开始，本研究在海州常山种质资源多样性研究中存在一些不足，例如不同地区采样的数量不均，而且本试验只用了AFLP技术，简单重复序列标记(simple sequence repeats，简称SSR)、相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，简称SRAP)等分子标记技术还未用于海州常山种质资源的遗传多样性的分析。下一步将采集样品较少地区的种质资源，并采用其他分子标记技术对其遗传多样性进行分析，寻找适宜该树种遗传多样性分析的分子标记技术，进一步确定海州常山不同地区种质资源的亲缘关系。

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