用超敏DNA提取试剂盒提取牙齿DNA

刘 峰，尹 路，陈爱萍，黄泳森

（广东省深圳市公安局龙岗分局刑警大队，广东 深圳 518172）

牙齿DNA的STR检验是当前鉴定无名尸骸的一种有效手段，其在基层法医物证实验室已较普及。但若实验室没有专业牙齿粉碎设备和牙齿裂解液，或会因牙齿的粉碎不够彻底而致裂解液不能发挥最大效能或者牙齿组织难以分解，因而导致检验结果不理想。笔者使用自制的牙齿粉碎设备，再以超敏DNA提取试剂盒增加裂解效能，缩短检验时间，提高DNA浓度，获得了有效的STR分型。

1 材料与方法

1.1 样本及主要试剂

3颗来自不同个体保存完整的切牙（2011和2013年实际案件检材，已做过检验，获得了完整分型并和失踪人员的家属经亲缘关系鉴定确定了其来源），分别编为1、2和3号。

超敏DNA提取试剂盒（上海惠文生物科技有限公司）；Identif i ler-Plus扩增试剂盒（Thermo Fisher公司，美国）；5% (质量浓度)次氯酸钠溶液；无水乙醇；0.5mol/L EDTA脱钙液（pH 8.0）；DTT溶液(1 mol/L)以及蛋白酶K溶液(20 mg/mL)等。

1.2 牙齿处理

三颗牙齿分别用清水洗净表面，再以手术刀片刮去牙齿表层及污垢物，用蒸馏水冲去浮垢，放入干净小烧杯中，加5% 次氯酸钠溶液浸泡15 min[1]后弃去溶液，蒸馏水泡洗3～5次，清除次氯酸钠，无水乙醇泡洗1次除去残余水份，用滤纸拭干，以紫外光照射各牙齿30 min。使用自制的牙齿粉碎器将三颗经预处理的牙齿分别研成粉末。

图1为牙齿粉碎器，由三部分组成。为减少磨损度以增加使用期限，其各部分表面均镀有金属铬。左侧为底座，半球形设计用以放置牙齿和收集牙粉，右侧为套管，套在底座和中间的圆柱上，用以防止牙齿四处溅落，并固定用力的方向。使用时，左侧底座凹槽用于放置已清洁的牙齿；右侧套管套在左侧底座之上；中间的圆柱形铁块上端球形面用于与底座凹槽相嵌合，下端平面则用于接受铁锤等击打物敲击。

图1 自制牙齿粉碎器Fig.1 Self-made device for tooth grinding

1.3 DNA提取

将每颗牙研粉均取两份，每份0.1 g，置于两个超敏DNA提取试剂盒配套的离心套管内（编号为A和B），分别加入260 μL预先混匀的试剂（包含有试剂盒中100 μL裂解液A、20 μL裂解液B以及20 μL DTT溶液、20 μL蛋白酶K溶液和100 μL EDTA脱钙液），56 ℃裂解6 h，99 ℃裂解10 min。而后，13 000 g离心10 s，再加入吸附液200 μL，1 3000 g离心2 min，加入吸附液950 μL及混匀的吸附珠悬液16 μL，室温静置15 min。8000 g离心30 min，充分移去上清液，先在A管沉淀物中加入-20 ℃漂洗液750 μL，充分混匀后将A管中的液体移至B管，并将B管沉淀物充分混匀。 8000 g离心30 min，充分去除漂洗液，管盖打开状态下56 ℃烘干吸附珠1 min。加入洗脱液30 μL，充分混匀后56 ℃保温15 min。8000 g离心30 s，取上清液备用。

1.4 PCR扩增

采用Identif i ler Plus扩增试剂盒扩增，反应总体积25 μL，其中包含前面提取的牙齿DNA上清液10 μL。热循环条件按试剂盒推荐参数设定。

1.5 电泳检测

扩增产物经3130 xL遗传分析仪检测，电泳按说明书规定进行，以GeneMapperID-X软件作STR分型。

2 结果与讨论

2.1 结果

三颗牙齿的STR分型结果都与档案室保存的STR分型结果一致，均可满足尸源认定要求（如图2）。

图2 1号牙齿STR分型Fig.2 STR genotype of the tooth 1

2.2 讨论

牙齿是白骨化尸体检验中的常见检材，从牙齿中提取DNA做STR分型是对白骨化尸体进行尸源鉴定的重要手段。但由于牙齿中的细胞含量相对较少，加之受时间、环境等因素的影响，故牙齿的DNA提取成为法医DNA检验的一大难点[2]。牙齿DNA提取可利用EDTA的脱钙作用软化骨组织，再结合蛋白酶K和表面活性剂对细胞裂解，可释放出深层骨组织中的DNA。骨骼脱钙后DNA检测结果证实明显优于未脱钙处理，表明脱钙有助于细胞的分散，会使骨粉变得粘稠细腻，易被裂解液充分消化[3]。但由于DNA是水溶性大分子，单独的脱钙步骤会因弃去脱钙液导致DNA损失，有研究[4]表明遗弃的脱钙液中含有大量DNA，损失率高达50%以上。

本方法使用超敏DNA提取试剂盒，经硅珠吸附提取DNA，脱钙液直接和裂解液、DTT、蛋白酶K以及牙齿粉末混合使用，省去了单独的脱钙步骤从而减少了因弃脱钙液导致的DNA损失。另外，使用硅珠试剂盒提取DNA的操作过程与步骤也相对简单，尤其无需移管，从而既有效减少了DNA损失又缩短了检验时间。

目前，国内DNA实验室进行牙齿DNA检测时，通常需要一颗磨牙的1/3。这些牙粉放置在1.5 mL离心管中裂解时，由于重力作用会产生积压，使骨粉不能和脱钙液、裂解液、DTT、蛋白酶K混合液等充分接触，因之降低了脱钙液和裂解液的效能。为解决这个问题，本方法使用两个超敏DNA提取试剂盒离心套管，既增大了反应体系的体积也充分增加了裂解液与牙粉的接触面积，从而提高了脱钙和裂解效能。然后在漂洗步骤时再将两个离心管的溶液合并接受漂洗与洗脱处理，就使最终的DNA浓度大大增加，STR的分型结果更好。

本方法在相关骨骼DNA提取研究[5]中也有类似应用，其实质都是简化实验操作步骤、增加脱钙裂解效能、浓缩纯化DNA的含量。目前，本实验室使用该方法提取牙齿DNA已有18宗案例，全部获得了完整的STR分型，其中有8宗案例和失踪人员的家属经亲缘关系鉴定确定了尸源。

综上，利用超敏DNA提取试剂盒提取牙齿DNA，能够获得良好的STR分型。本方法尤其适用于一些检材量少或者时间紧急的案件。至于时间更长（5年以上）的牙齿是否适用，暂未研究，待再积累检材后作探讨。

［1］ KEMP B M, SMITH D G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth［J］. Forensic Science International, 2005, 154: 53-61.

［2］ 涂政，刘志芳，陈松，等. 牙齿的DNA提取及STR分型研究［J］. 刑事技术，2007(5): 9-11.

［3］ RUCINSKI C, MALAVER A L, YUNIS E J, et al. Comparison of two methods in isolating DNA from human skeleton for STR analysis［J］. Journal of Forensic Science, 2012, 57(3): 706-712.

［4］ 李花，涂政，石屹，等. 骨骼脱钙后DNA含量损失问题初探［J］. 中国法医学杂志，2014, 29(2): 141-144.

［5］ 涂政，石屹, 张广峰, 等. 一种焚烧骨骼的DNA提取方法.刑事技术, 2016, 41(1): 77-79.