李秀娟,孙 川,陈卫光,黄胜起,许蓓妮,陈建勇
(1.江门市中心医院 检验科,广东 江门529000;2.江门市中心医院 肾内科;3.江门市新会区妇幼保健院 检验科;4.江门市中心医院 感染管理科)
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一类病因复杂又缺乏有效治疗手段的慢性进行性自身免疫性疾病。大量资料研究表明,在欧洲白种人群中强直性脊柱炎的发病率约为0.5%,在中国该疾病的发病率约为0.3%,而在非洲的黑色人种人群该疾病几乎不发病;对单卵双生的人群研究显示,遗传度>90%,遗传因素在AS发病中占了主导地位。这些研究均提示人群的特异性及遗传基因易感性在AS发病机制中具有重要的作用。在所有易感基因中,HLA-B27是和AS相关性最强的,相关性达到了90%以上,是研究最彻底和最深入的一个易感基因。然而,在B27 阳性人群中只有1%-5%最后发展为AS,提示除了在HLA 区域存在AS的易感基因外,其他染色体可能也存在着本病的易感基因。近来多项研究发现基因单核苷酸多态性在疾病的发生中起着重要的作用,其中研究提示IL-23R SNPs与AS的发病存在相关。IL-23R SNPs与AS的相关性研究显示,不同地区、不同种族的人群,IL-23R SNPs分布是不一样的,目前,关于IL-23R SNPs与AS相关性研究结论不一致。
为了探讨广东五邑地区汉族人群中AS的易感性与IL-23R SNPs是否存在相关,本研究采用Sequenom MassArray质谱阵列技术检测AS患者白细胞介素-23R 基因5个位点的SNPs,并与健康对照组进行比较。
江门市中心医院2013年02月-2016年02月住院及门诊患者50例并得到患者同意,其中男性38例,女性12例,年龄13-46岁,平均年龄28.01岁。选择本院体检中心来体检的70例健康人作为正常对照组,其中男性51例,女性19例,年龄23-35岁平均年龄30.04岁。两组性别构成,平均年龄差异在统计学上无显著区别义(P>0.05)。所选研究对象之间均无血缘关系,并且详细询问过病史。实验组入选标准:①符合1984年美国风湿病学会修订的AS诊断标准。AS患者HLA-B27均为阳性。 ②实验对照组的各项指标均阴性,且为本院体检中心健康体检者; 排除标准:①伴有如银屑病性关节炎 、类风湿性关节炎等相关的自身性免疫性疾病;②心脑血管疾病或血液系统疾病;③重型感染及其他感染性疾病如病毒性肝炎及HIV感染者等。
美国ABI公司的ABI veriti-384 PCR仪;Major science 公司的Smart view pro 1100凝胶电泳成像仪;Sequenom,Inc 公司的MassARRAY Analyzer 4.0质谱仪、iPLEX Reagent Kit;BioTeKe Corpration全自动核酸提取仪器。
1.3.1基因组DNA提取 采集研究对象外周空腹静脉血3 ml,乙二胺四乙酸抗凝,储存于-80℃冰箱内备用。采用全血基因提取试剂盒提取DNA,具体步骤:①配制蛋白酶K溶液,在每支粉剂中加入蛋白酶K稀释液,颠倒混匀,最终浓度为10 mg/ml;②在96孔板1、7列中分别加入15 μl蛋白酶K,核酸释放剂60 μl,200 μl样本;③样本和试剂加好后放入自动化核酸提取仪器中,选取已经设置好的程序提取;④核酸提取结束后将96孔板的第6和第12列含有核酸的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中,使用NanoDrop LITE仪器进行OD值检测,用1.50%琼脂糖凝胶跑电泳检测DNA浓度,DNA合格的样本, 放置-20℃储存备用。
1.3.2SNP点选择 选取目前研究较多,且与AS相关性分析结论不一致的5个位点:rs11209026、rs11465804、rs10489629、rs7517847、rs1343151。
1.3.3IL-23R的MassArray基因分型方法检测 根据SNP位点序列信息,使用sequenom公司的引物设计软件Assay design 3.1设计PCR反应和单碱基扩展引物,委托华大基因生物公司合成。模板扩增PCR反应:5 μl体系,94℃ 5 min ,45个循环,每个循环有3个温度,94℃ 20 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min ,最后72℃延伸3 min ,4℃保存; 单碱基延伸PCR反应:9 μl体系,94℃ 30 s ,40个循环[ 94℃ 5 s,(5个循环,每个循环有2个温度52℃ 5 s,80℃ 5 s) ],最后72℃延伸3 min,见表1。
表1 IL-23R序列特异性引物
得到的扩增产物,用树脂纯化,纯化后的产物移至SpectroCHIP bioarray上,用质谱仪MALDI-TOF分析,用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分析图。
分别进行基因型频率及等位基因频率计算,并且检验Hardy-Weinberg平衡和MAF(最小等位基因频率)。采用直接计数法计算病例组和对照组间基因型频率和等位基因频率。各组间率的比较采用Kappe检验;计算P值,优势比(OR)及其95%可信区间(95% CI)。所有统计检验均为双侧检验,P<0.05表示差异有统计学意义。所有统计采用SPSS 13.0统计软件进行。
所有纳入的研究对象均分型成功,所有受试者rs11209026、 rs1343151和rs11465804位点的基因型均为纯合子,其中,rs11209026的基因型为GG,rs1343151的基因型为CC,rs11465804的基因型为TT,这与HapMap数据库的报道一致。因此,rs10489629和rs7517847位点用于病例对照研究。用于病例对照研究的2个SNP位点的基因频率分布均未偏离哈迪温伯格平衡,表明样本来源的人群具有群体代表性。
rs10489629基因多态性分型:实验组和实验对照组检出G/G, A/G和 A/A 3种基因型 ;AS患者及对照组间IL-23R基因rs10489629位点G等位基因和A等位基因频率分布差异有统计学意义(P<0.05 );GG、AG和AG基因频率在两组间的分布有统计学意义(P<0.05),实验组携带AA基因型频率显著高于对照组;基因型回归分析显示,携带IL-23R基因rs10489629位点AA基因型与GG基因型比较,显著增加AS的罹患风险(OR=7.161,95%CI=1.488-34.462,P=0.014);携带IL-23R基因rs10489629位点A基因与G基因比较,显著增加AS的罹患风险(OR=3.247,95%CI=1.699-6.207,P=0.000);两组间等位基因频率与基因型分布结果见表2。
表2 人IL-23R基因 rs10489629基因型和等位基因分布
rs7517847基因多态性分型:实验组和实验对照组均检出G/G, G/T和 T/T 3种基因型;实验对照组与AS患者两组间IL-23R基因rs7517847位点的等位基因G和等位基因T频率分布在统计学上无显著差异(P>0.05);G/G, G/T和 T/T 3种基因型频率在实验对照组与AS患者两组间的分布无显著统计学意义(P>0.05 );在实验对照组与AS患者两组间等位基因频率与基因型分布结果见表3。
表3 人IL-23R基因 rs7517847基因型和等位基因分布
SNP是由于单个碱基的变化,如转换、颠换、插入、缺失等造成的DNA 序列多态性,在人群中其频率大于1%。SNP在人类基因组中分布范围广且十分稳定,在人类复杂疾病病因研究中,探讨SNP 与复杂性疾病的关联性,一直是揭示疾病基因易感性的最重要途径。
AS 属于一种自身性免疫性疾病,该疾病与环境及遗传等多种因素有关,同时也属于多基因遗传病范畴也称为复杂性疾病。AS 具有高度遗传性,和所有多基因遗传病一样,许多候选基因与AS的相关性目前尚无明确定论。IL-23是在免疫调节中起着重要的作用,它是一个由亚单位p19和IL-12的p40通过二硫键形成的异源二聚体分子,IL-23通过刺激Thl7细胞发生异常聚集,从而使Th17细胞产生大量IL-17细胞因子,进而IL-17细胞进一步影响其他多个炎症性细胞因子的产生和活化,从而发挥了促炎症作用及严重的自身免疫反应[1]。在AS疾病中IL-23与IL-23R受体结合,诱导IL-17的产生[2],促使血清中IL-17水平显著升高,并且血清中IL-17可能通过刺激Kβ受体活化因子配体(RANKL)的表达,从而有助于AS患者骨骼破坏的发生[3]。IL-23R基因变异体被认为是人类自身免疫性疾病的易感基因,诸如IBD、银屑病和多发性硬化症等发病均与其有关[4-7]。目前,很多学者的研究显示[8],在IL-23R 的基因内存在多个SNP位点与AS的发病机制有关,但具体的发生机制不明确。目前大部分观点认为IL-23R SNP可能通过影响细胞的功能,使IL-23/Th17免疫轴(IL23-IL23R-Th17-IL17) 发生紊乱,从而导致机体发生慢性炎症和组织的损伤[9]。
IL-23R SNPs与AS的相关性研究显示,不同地区、不同种族的人群,IL-23R SNPs分布是不一样的。陈真[10]对福建地区AS患者3个IL-23R基因位点进行研究未发现rs11209032、rs11209026及rs11465804与AS相关,而王新卫[11]的课题组研究显示rs11209032位点的各基因型及等位基因频率分布在AS与对照组间存在着统计学差异,推测IL-23R可能是AS的一个易感基因。Rahman 等[12]对加拿大人群AS研究显示,IL-23R基因位点rs10489629、rs2201841及rs11465804与AS有显著相关性。目前,关于IL-23R SNPs与AS相关性研究结论不一致。鉴于此,本课题对广东五邑地区汉族人群的AS患者进行了分析研究。本研究显示广东五邑地区AS患者IL-23R基因rs11209026、 rs1343151和rs11465804位点的基因型均为纯合子,其中,rs11209026的基因型为GG,rs1343151的基因型为CC ,rs11465804的基因型为TT,这与陈真、王新卫及韩国[10,11,13]的报道一致,但和加拿大的报道不同[12]。原因可能韩国和中国汉族人群都是属于亚洲地区,而加拿大属于欧洲地区,也进一步验证了不同地区及种族IL-23R SNPs分布是不一样的。因此,我们认为在分析IL-23R SNPs与疾病风险关系时,应将地区及种族因素考虑在内。
本研究显示IL-23R基因rs10489629位点在AS患者与对照组间分布存在着显著的统计学差异。本实验分析的数据包括P值、OR值及95% CI,结果显示IL-23R基因rs10489629位点,AS患者携带AA基因型频率显著高于对照组;基因型回归分析显示,携带IL-23R基因rs10489629位点AA基因型显著增加AS的罹患风险;携带IL-23R基因rs10489629位点A基因与G基因比较,显著增加AS的罹患风险。说明个体拥有不同的基因型或携带不同的等位基因可能与AS的易患性有关。当rs10489629位点存在A等位基因时,通过统计学对AS危险因素分析显示,95% CI的下限值为1.699 且大于1,从统计学上认为带有这种等位基因的个体具有相对较高的患AS 疾病倾向,其相对应的等位基因有可能为易感基因。这和国内周林[14]、张吉林[15]及Karaderi T[16]的报道一致。
本研究未发现IL-23R基因rs751784位点在AS与对照组间存在统计学差异。但本研究提示IL-23R 基因rs10489629位点基因多态性与AS易感性存在一定的关联。因此,进一步说明IL-23R基因在AS发病机制中的重要作用。截止目前,许多学者认为,IL-23R 基因多态性在强直性脊柱炎发病机制中起着关键的作用,由于本实验所选取的对象仅对广东省五邑地区的人群、研究的位点不多,并没有选取IL-23R的所有SNP位点、研究的样本量也比较小,所以在未来的研究中我们将进一步加大样本量及扩大研究对象范围,进一步证实IL-23R基因对AS易感性的关联。从而为对AS发病机制新的认识奠定基础,为AS的诊断、治疗带来新的前景。
作者简介:李秀娟(1980-),副主任技师,硕士,主要从事遗传分子生物学研究。
参考文献:
[1]Bettelli E,Oukka M,Kuchroo V K.T(H)-17 cells in the circle of immunity and autoimmunity[J].Nat Immunol,2007,8(4):345.
[2]王新卫,林智明,廖泽涛,等.IL-23与IL-17在强直性脊柱炎患者中表达的初步研究[J].中国免疫学杂志,2009,25(3):266.
[3]Wendling D,Cedoz J P,Racadot E A.Serum IL-17,BMP-7,and bone turnover markers in patients with ankylosing spondylitis[J].Joint Bone Spine,2007,74(3):304.
[4]Tremelling M,Cummings F,Fisher S A,et al.IL23R variation determines susceptibility but not disease phenotype in inflammatory bowel disease[J].Gastroenterology,2007,132(5):1657.
[5]Duerr R H,Taylor K D,Brant S R,et al.A genome-wide association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene[J].Science,2006,314(584):1461.
[6]Cargill M,Schrodi S J,Chang M,et al.A large-scale genetic association study confirms ILl2B and leads to the identification of IL23R as psoriasis-risk genes[J].Am J Hum Genet,2007,80(2):273.
[8]Chen C,Zhang X,Li J,et al.Associations of IL-23R polymorphisms with ankylosing spondylitis in East Asian population:a new case-control study and a meta-analysis[J].Int J Immunogenet,2012,39(2):126.
[9]Dicesare A,Dimeglio P,Nestle F O.The IL-23/Th17 axis in the immunopathogenesis of psoriasis[J].J Invest Dermatol,2009,129(6):1339.
[10]陈 真,苏松森,林 玲,等.自细胞介素-23受体基因多态性对强直性脊柱炎易感性的影响[J].临床医学工程,2014,21(1):16.
[11]王新卫,黄进贤,林智明,等.白细胞介素-23R单核苷酸多态性与中国汉族人群强直陛脊柱炎的关联分析[J].中华风湿病学杂志,2008,12(10):670.
[12]Rahman P,Inman R D,Gladman D D,et al.Association of interleukin-23 receptor variants with ankylosing spondylitis[J].Arthritis Rheum,2008,58(4):1020.
[13]Sung I K,Kim T H,Bang S Y,et al.IL-23R polymorphisms in patients with ankylosing spondylitis in Korea[J].Journal Rheum,2009,36(5):1003.
[14]周 林,赖 蓓,黄慈波,等.IL-23R 基因多态性与北京人群强直性脊柱炎患病风险的关联性研究[J].宁夏医科犬学学报,2012,34(6):548
[15]张吉林,刘 冲,单雪梅,等.IL-23 R基因多态性与吉林人群强直性脊柱炎易感性的关联研究[J].中国免疫学杂志,2015,31(2):230.
[16]Karaderi T,Harvey D,Farrar C,et al.Association between the interleukin 23 receptor and ankylosing spondylitis is confirmed by a new UK casecontrol study and meta-analysis of published series[J].Rheumatology,2009,48(4):386.