金纳米粒子模拟过氧化物酶的初步研讨

刘竞文，关桦楠，张家成

（哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076）

金纳米粒子是目前所发现的一类贵金属纳米材料。带正电荷或者带负电荷的金纳米粒子，其金纳米粒子表现出类似的过氧化物酶的催化活性[1-2]。Wang S等人[3]研究表明，模仿过氧化物酶的催化能力是来自黄金纳米粒子的本身。修饰的金纳米粒子表面改变修饰剂和底物的结合能力，最终控制了纳米粒子的催化活性。

金纳米粒子在生物医学检测等领域有着较为广泛的应用，而且与葡萄糖氧化酶、葡萄糖催化能力极其相似。基于有过氧化物酶性质的双金属合金纳米粒子Ag@M（M-Pt，Au和Pd），也有一些酶的性质[4]。以弱还原剂还原双金属离子制备了银基双金属中空-介孔纳米材料，其催化活性可以通过不同比例的2种金属调整，这是除了规定的大小和酶的催化能力外模拟调节有效方法。

天然酶因其催化效率高和反应特异性较强，在医药、化工、食品和农业等领域得到广泛应用。然而，天然酶容易受环境的影响而失去催化活性。此外，制备、纯化和贮藏时浪费时间比较多。因此，研究和开发具有催化活性的来源丰富、价格低廉及稳定的仿照酶具有重要意义。纳米材料因其表面效应和量子尺寸效应而在许多领域得到了广泛的应用[5-6]。氧化物纳米材料与碳基纳米材料、贵金属纳米材料已经被发现并摹仿了酶的特性。与天然酶（Natural enzyme） 相比较，仿照酶具有催化活性高、稳定性好、可控合成的成本低等优点[7-8]。基于此，试验采用的葡萄皮浸泡液进行绿色还原法制备金纳米粒子，对其进行表征，并窥探金纳米粒子的过氧化物酶仿照酶活性，确定仿照酶催化体系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

双氧水、碳酸钾、硼氢化钠、乙酸、乙醇，上海振兴化工一厂提供；氯金酸，天津市华东试剂厂提供，以上试剂均为分析级。

1.2 仪器与设备

H-7500型透射电子显微镜，日本电子株式会社产品；LDJ 9600型振动磁强计，北京翠海佳诚磁电科技有限责任公司产品；BT-9300H型激光粒度分布仪，美国麦克仪器公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 金纳米粒子的制备与表征

将100 g的葡萄皮浸泡于水温为80℃的200 mL去离子水中，自然冷却至室温。将浸泡液于离心机中以转速4 000 r/min离心3 min，抽取上清液作为母液（即100%工作液）。用去离子水将母液分别浓缩且获得质量分数为50%，20%，10%，1%的母液葡萄皮工作液200 mL，置冰箱4℃条件下保存（不超过2 d），在室温条件下，将提前在4℃预冷的氯金酸溶液（20 mL，1%，W/V） 置于反应皿中，伴随磁力搅拌器温和搅动；2 min后，迅速加入不同质量分数（50%，20%，10%，1%） 的工作液5 mL，立即观察各个试管中颜料的变化，即系统溶液颜料由黄色变为紫色再变为酒红色，当溶液颜料出现酒红色时，搅拌速度加快，20 min后结束反应，并将反应液放在冰箱4℃条件下保存。

吸取1 mL的金纳米粒子溶胶后加入到比色皿中，立即再加入2 mL的去离子水，然后混合均匀，放于紫外-可见光分光光度计中，扫描金纳米粒子的吸收光谱，确定最大吸收峰波长（520～550 nm），比较不同质量分数的浸泡液所制备金纳米粒子的可见光吸收光谱，从而初步判别金纳米粒子的粒径与含量。溶液中金纳米粒子的粒度分布情况由激光粒度仪来窥探。观察金纳米粒子的表观形貌用透射电子显微镜。

1.3.2 单要素优化金纳米粒子模拟酶催化体系

（1）H2O2浓度对催化体系的影响。将1 mL的金纳米粒子溶胶加入到盛有5m L的HCl-NaAc缓冲液（pH值5） 的离心管中，再依次加入200 μL的四甲基联苯胺溶液（TMB，25 mmol/L)）和500 μL的H2O2（0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 mol/L），混合均匀后，将反应体系放置于40℃的水浴锅中，水浴10 min后取出（水浴行程中每过1 min温和倒转1次），吸取上清液3 mL，以蒸馏水为空缺，测定于波长652 nm处吸光度，重复试验3次。

（2）催化温度对催化体系的影响。将1 mL金纳米粒子溶胶加入到盛有5 mL的HCl-NaAc缓冲液（pH值5） 的离心管中，再依次加入200 μL的四甲基联苯胺溶液 （TMB，25 mmol/L） 和 500 μL的H2O2（1.00 mol/L），混匀后，将反应体系放置于不同催化温度（30，35，40，45，50℃） 水浴锅中，水浴10 min后（水浴行程中每过1 min温和倒转1次）取出，静置1 min，吸取上清液3 mL，蒸馏水为空缺，测定于波长652 nm处吸光度，重复试验3次。

（3）催化时间对TMB浓度体系的影响。将1 mL金纳米粒子溶胶加入到盛有5 mL HCl-NaAc缓冲液（pH值5） 的离心管中，再依次加入200 μL的四甲基联苯胺溶液（TMB，25 mmol/L） 和500 μL的H2O2（1.00 mol/L），混匀后，将反应体系放置于40℃水浴锅中，水浴不同催化时间（5，10，15，20，25 min）后取出（水浴行程中每过1 min温和倒转1次），静置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸馏水为空缺，测定于波长652 nm处吸光度，重复试验3次。

1.3.3 正交设计优化金纳米粒子模拟酶催化体系

分别窥探H2O2浓度（A）、催化温度（B） 和催化时间（C）对整个试验体系的影响，每种要素设计3个水平（根据单要素试验优化得出），选用L9（34）正交表优化试验方案。

因素程度见表1。

表1 因素程度

第3列为空列，作为误差来源，拨取直观阐述法确定要素影响的主次依序及优选方案，采用方差阐述法确定要素对体系的影响程度。根据正交设计表，分别制备不同的处理，将1 mL金纳米粒子溶胶加入到盛有5 mL的HCl-NaAc缓冲液（pH值5） 离心管中，再依次加入200 μL的四甲基联苯胺溶液（TMB，25 mmol/L） 和 500 μL 的 H2O2（单因素优化结果），混匀后，将反应体系放置于水浴锅中（催化温度为单因素优化结果），水浴一段催化时间（单因素优化结果）后取出（水浴行程中每过1 min温和倒转 1次），静置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸馏水为空缺，测定于波长652 nm处吸光度，目标越大越好，重复试验3次。

2 结果与分析

2.1 金纳米粒子的表征

在金纳米粒子众多的制备方法中，最常见的就是化学还原制备法，其原理是向一定浓度的金离子溶液中加入化学还原剂，将三价态的金离子还原为零价态的金，从而制备出金纳米粒子。借鉴此原理，选择含有丰富还原性物质的葡萄皮浸泡液制备金纳米粒子。葡萄皮浸泡液含有丰富的抗坏血酸和黄酮类物质，具有良好的还原性，可以制备金纳米粒子。

葡萄皮浸泡母液及不同质量分数葡萄皮浸泡液制备的纳米粒子溶胶见图1。

在试验的操作行程中可以清晰地看到，反应溶液由黄色变为紫色再变为酒红色，说明有金纳米粒子的生成。为了探究不同质量分数葡萄皮浸泡液所制备金纳米粒子的性能区别，将对所制备的金纳米粒子进行体系的表征。

图1 葡萄皮浸泡母液及不同质量分数葡萄皮浸泡液制备的纳米粒子溶胶

紫外-可见吸收光谱是研讨胶体金的常用方法，紫外-可见光谱对高分散和缔合态存在的金属颗粒有完全不同的响应，通过阐述其谱图，可以得到有关颗粒大小和形状等重要信息。在波长520 nm附近出现的吸收峰，可被指认为金纳米颗粒的等离子共振紫外吸收特征峰，此吸收峰的位置、形状与颗粒的大小、形状与分散状态密切相关。根据Mie理论，金纳米粒子会在波长520 nm左右出现明显的吸收峰。

不同质量分数葡萄皮浸泡液制备金纳米粒子的紫外-可见光吸收光谱见图2。

图2 不同质量分数葡萄皮浸泡液制备金纳米粒子的紫外-可见光吸收光谱

根据图2中的结果显示，不同质量分数的浸泡液所制备的金纳米粒子在粒径和含量上具有较明显的区别。紫外-可见光吸收光谱的结果表明，4种质量分数葡萄皮浸泡液所制备的金纳米粒子在波长530～569 nm范围内具有明显的吸收峰，根据吸光度值初步判断，都获得了金纳米粒子。1%，10%，20%浸泡液所制备的金纳米粒子，在波长540 nm附近出现了特征吸收峰。但是，伴随着浸泡液质量分数的增大而峰值逐渐下降，说明金纳米粒子生成的数量伴随浸泡液质量分数的提高而在减少，原因可能是葡萄皮中除含有还原性物质之外还含有高质量分数的大分子物质（如氨基酸或者有机酸等），这类物质反而抑制了金种的生长，造成金种的聚集，使其无法获得合适粒径的金纳米粒子。与此同时，50%浸泡液所制备的金纳米粒子吸收峰发生偏移，说明金纳米粒子整体粒径变大，催化性能下降，不宜用于下一步试验。

分别在1%，10%，20%的3个浸泡液质量分数条件下，所合成金纳米粒子的粒径大小区别较大。根据吸收峰波长位置，初步判定3种质量分数浸泡液所制备出的金纳米粒子粒径都在可接受的范围内，由小到大依次为1%，10%，20%浸泡液质量分数。因此，选择这3种质量分数的浸泡液所制备的金纳米粒子参与下面的试验。

针对筛选的3种质量分数葡萄皮浸泡液所制备出的金纳米粒子，采用透射电子扫描显微镜观察其外观形貌和粒径大小。

透射电子扫描显微镜图片见图3。

图3 透射电子扫描显微镜图片

由图3可知，3种质量分数浸泡液所制备出的金纳米粒子形状均一，基本呈现圆球形。其中，1%质量分数浸泡液所制备出的金纳米粒子分散度最好，基本没有聚集；而10%和20%质量分数浸泡液所制备出的金纳米粒子都呈现出不同程度的聚集，衡量金纳米粒子的聚集情况决定了金纳米粒子的稳定性。由激光粒度仪测定结果可知，1%质量分数浸泡液所制备出的金纳米粒子平均粒径约为7 nm；10%质量分数浸泡液所制备出的金纳米粒子平均粒径约为10 nm；20%质量分数浸泡液所制备出的金纳米粒子平均粒径约为8 nm。根据粒径越小、活性越强的原理，选择1%质量分数的葡萄皮浸泡液所制备的金纳米粒子参与模拟酶活性试验。

2.2 单因素试验结果阐述

2.2.1 H2O2浓度对催化体系的影响结果

由于TMB的反应产物为深蓝色，且反应产物越聚越大，所以颜色越深说明模拟酶催化活性越大，根据此特点来测定于波长652 nm处H2O2浓度的吸光度，并确定用吸光度作为单因素优化的评定目标，窥探不同H2O2浓度对催化体系的影响。

H2O2浓度对催化体系的影响结果见图4。

由图4可知，H2O2浓度对催化体系有直接影响。H2O2浓度在0.05～0.25 mol/L时，随着H2O2浓度的增长催化效率越来越高。H2O2浓度在0.25～1.00 mol/L时，对反应催化效率越来越低。在模拟酶催化体系中H2O2浓度取 0.10，0.25，0.50 mol/L。

2.2.2 催化温度对催化体系的影响结果

图4 H2O2浓度对催化体系的影响结果

采用单因素变量法选定模拟酶活性试验不同因素的最适程度。首先，选取稳定H2O2浓度（1.0 mol/L），催化时间30 min时。由于TMB的反应产物为深蓝色，且反应产物越聚越大，所以颜色越深说明催化活性越大，通过测定于波长652 nm处的吸光度，并以吸光度作为单因素优化的评定目标，窥探不同催化温度对催化体系的影响。

催化温度对催化体系的影响结果见图5。

图5 催化温度对催化体系的影响结果

由图5可知，催化温度在30～40℃时，随着催化温度的增长，催化效率越来越高，40℃时催化效率达到最高值，随后随着催化温度上升而下降，说明纳米金的催化能力在40℃最强。选取35，40，45℃为正交因素。

2.2.3 催化时间对催化体系的影响结果

采用单因素变量法选定模拟酶活性试验不同因素的最适程度。选取稳定H2O2浓度（1.0 mol/L），催化温度40℃，由于TMB反应产物有深蓝色，所以通过测定于波长652 nm处的吸光度，并以吸光度作为单因素优化的目标。以吸光度为衡量目标，窥探不同催化时间对催化体系的影响。

催化时间对催化体系的影响结果见图6。

图6 催化时间对催化体系的影响结果

由图6可知，随着催化时间的增长催化效率越来越高，但最终趋于平缓。出于经济效益的考虑，在5～10 min时，对反应催化效率越来越低。在模拟酶催化体系中催化时间取15，20，25 min。

2.3 正交试验设计优化模拟酶催化反应体系

试验在单因素试验的基础上，选择3个较好程度，其中选取H2O2浓度（A）、催化温度（B） 和催化时间（C）对整个试验的影响。以于波长652 nm处的吸光度作为评价指标，采用L9（34）做正交试验表进行正交试验，再通过极差阐述确定最佳工艺条件。

正交试验结果与分析见表2。

表2 正交试验结果与分析

由表2阐述可得，使用DPS软件进行极差阐述得出数据，根据试验各因素模拟催化酶体系的影响力，其影响主次因素依序为A＞B＞C，即H2O2浓度＞催化温度＞催化时间。而通过极差分析来确定最优方案组合，最优方案组合为A2B1C2，即H2O2浓度0.25 mol/L，催化温度35℃，催化时间20 min。综上所述，催化时间是影响模拟酶催化体系的主要因素，H2O2浓度和催化温度对模拟酶体系也有一定的影响。

3 结论

采用绿色合成法制备金纳米粒子，并采用单因素试验及正交表设计优化金纳米粒子模拟酶催化活性体系，为探究催化温度、催化时间和H2O2浓度对试验体系的影响，得到如下的试验结果：

（1）不同质量分数浸泡液所制备的金纳米粒子在粒径和含量上具有较明显的区别，1%，10%，20%质量分数浸泡液所制备出的金纳米粒子粒径分别为 7，10，8 nm。

（2）通过单因素试验和正交试验的结果，试验得出各要素模拟催化酶体系的影响，其主次依序为A＞B＞C，即H2O2浓度＞催化温度＞催化时间。通过极差阐述来确定最优的方案组合，最优方案组合为A2B1C2，即H2O2浓度0.25 mol/L，催化温度35℃，催化时间20 min。综上所述，反应时间是影响模拟酶催化体系的主要因素。

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