高效液相色谱法测定人血清万古霉素浓度

李 容

（重庆市涪陵中心医院药学部，重庆 408000）

万古霉素是有抗生素后效应的时间依耐性抗菌药物，抗感染治疗成败与其血药谷浓度密切相关，血药谷浓度应控制在10～20 mg/L，至少要保持在10 mg/L以上，以避免发生耐药[1]。万古霉素的用药人群包括新生儿、婴幼儿、老年人、肾功能不全及长期应用万古霉素的患者等特殊人群，应用时必须严格调整剂量，并进行血药浓度监测。本研究中用高效液相色谱（HPLC）法测定人血清中万古霉素浓度，不仅可以为临床万古霉素的血药浓度监测提供试验手段，为临床合理用药提供理论依据，还可为患者制订个体化给药方案，减少用药后的不良反应。目前，国内外对人血清中万古霉素的浓度监测方法有6类，即微生物检测法[2]、酶放大免疫法（EMIT）[3]、荧光偏振免疫法（FPIA）[4]、液相色谱 -质谱联用法（LC-MS/MS）[5]、离子对色谱法[6]、高效液相色谱法。由于微生物检测法耗时较长且精密度低，EMIT和FPIA的专属性较差，LC-MS/MS法仪器价格昂贵致前期投入较大，而高效液相色谱法具有提取率高、重复性好、稳定性好、灵敏度高、操作简便等特点，因此，我院亦采用HPLC法测定万古霉素的血药浓度。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV-2401PC型紫外分光光度计（日本岛津公司）；高精度电子天平（上海光正医疗仪器股份有限公司）；pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；TG16W型医用高速离心机（长沙平凡仪器仪表股份有限公司）；TD4B型医用离心机（长沙平凡仪器仪表股份有限公司）。

1.2 试药

万古霉素标准品（中国食品药品检定研究院，纯度为 99%，批号为 130360-201302）；甲醇（批号为20160601），乙腈（批号为 20151111），均为色谱纯，由美国Burdick&Jackson公司提供；磷酸二氢钾（批号为2016042801），三氯乙酸（批号为 2016073101），均为分析纯，由成都市科龙化工试剂厂提供；磷酸（分析纯，重庆川东化工集团有限公司，批号为20160509）；试验用水为本院自制重蒸馏水，空白血清为本院检验科采集。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：VP-ODSC18柱（150mm×4.6mm，4.6μm）；流动相：0.05 mol/L 磷酸二氢钾缓冲溶液（pH=3.2）-甲醇（83∶17）；流速：1mL/min；紫外检测波长：205nm；柱温：25℃；进样量：20μL。

2.2 溶液配制

流动相配制：取磷酸二氢钾6.805 g，精密称定，置1000mL烧杯中，用1000mL蒸馏水溶解，搅拌均匀，用磷酸调节溶液的pH，缓慢滴加，边滴加边用玻璃棒搅匀，直至溶液的pH达3.2，即配制成0.05mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液（pH=3.2），置阴凉处保存，备用。

标准贮备液：取0.045 0 g万古霉素标准品，精密称定，置50 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，摇匀，即配制成质量浓度为980 μg/mL的标准贮备液，于冰箱中4℃冷藏，备用，使用时稀释为所需质量浓度。

蛋白沉淀剂：称取三氯乙酸10 g，用纯化水溶解至100 mL，摇匀，即得10%三氯乙酸溶液，用微量移液器分别移取1 200 μL 10%三氯乙酸溶液和300 μL乙腈置EP管中，震荡摇匀，置阴凉处保存，备用。

2.3 血清样品预处理

抽取使用过万古霉素患者的静脉血约3 mL，置普通抽血管中，以2 500 r/min的速率离心5 min，取上层血清样品 200 μL，置 2.0 mL EP 管中，再加入 150 mL蛋白沉淀剂[10% 三氯乙酸 -乙腈（1 200 μL ∶300 μL）]，以12 000 r/min的速率离心15 min，取上清液 20 μL进样。

2.4 方法学考察

专属性试验：在选定的样品处理方法和色谱分离条件下，测定空白血清、空白血清加标准品及血清样品的色谱峰。按拟订色谱条件进样测定，血清中干扰物质峰主要出现在12.5 min前，故把万古霉素的保留时间（tR）控制在14 min左右，万古霉素与血清中的干扰物质能得到良好分离，同时分离时间也不太长，保证了实验时间的合理性和可控制性。色谱图见图1。

线性关系考察：用微量移液管分别取10，20，40，60，80，100，120 μL 万古霉素标准贮备液，置 2.0 mL EP管中，分别加入纯化水 190，180，160，140，120，100，80 μL，振荡 3 min，摇匀；取上述溶液各 20 μL 置另一系列EP管中，各加入180 μL空白血清，振荡3 min摇匀，配置成质量浓度分别为 4.90，9.80，19.60，29.40，39.20，49.00，58.80 μg/mL 的溶液；再各加入 150 μL蛋白沉淀剂，振荡3 min，摇匀；最后置离心机中，以12 000 r/min的速率离心15 min，取出；按拟订色谱条件进样测定，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y=26 385X-19 207，r=0.999 6（n=7）。结果表明，血清质量浓度在 4.90 ～58.80 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好；最低检测限为 1.96 μg/mL（n=7）。

精密度试验：取适量万古霉素标准溶液加至180 μL空白血清中，分别配制成质量浓度为 9.80，19.60，29.40，39.20 mg/L 的血清样品溶液，按专属性试验方法处理样品，吸取上清液20 μL直接进样，1 d内重复测定5次，每次分析17 min，连续测定5 d。结果见表1。可见该方法的日内、日间 RSD均低于4%（n=5）。

绝对回收率试验：精密吸取万古霉素对照品贮备液，配制质量浓度为 9.80，19.60，29.40 mg/L 的万古霉素血清样品，按2.2项下方法处理样品，每一质量浓度平行操作5份，取20 μL进样，将仪器检测到的质量浓度与实际配制质量浓度相比得方法回收率，详见表2。

图1 高效液相色谱图

表1 日内、日间精密度试验结果（n=5）

表2 绝对回收率试验结果（n=5）

稳定性试验：制备 4.9，39.2，58.8 μg/mL 低、中、高3种质量浓度万古霉素血清样品各3份，于冰箱冷藏室（2～8℃）冷藏 1，2，4 d，考察其稳定性，结果见表 3。

表3 稳定性试验结果（n=3）

2.5 临床应用

2.5.1 病例分析

患者，男，50岁，体质量60 kg，因糖尿病伴多种并发症及肺部感染，于2017年1月23日入住重症监护室（ICU），入院后立即给予心电监护、吸氧、保留导尿、建立静脉通道、行床旁心电图。微生物检查报告导管血及导管尖端培养均有表皮葡萄球菌感染，痰培养提示有肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌感染。结合患者病情考虑为导管相关脓毒血症，给予万古霉素、氟康唑、哌拉西林他唑巴坦等抗生素进行抗感染治疗。在使用万古霉素前，患者的血清肌酐为417.7 μmol/L，肌酐清除率为 15.80 mL/min，医师给予“万古霉素 1 g，q12 h”静脉微泵输入，连用3 d后于再次给药前取患者血清，送检，用HPLC法测定万古霉素的血药浓度，测定值为48.71 μg/mL（重症患者参考值为 15 ～20 μg/mL），医师调整给药方式为“0.5 g，biw，ivgtt”，24 h 后测定患者的血肌酐为 686.1 μmol/L，肌酐清除率为 9.62 mL/min，仍持续使用万古霉素等抗生素1周后，静脉导管尖端培养未见细菌生长，患者病情好转，一般情况尚可，肾功能损害较大，转出ICU，转入肾内科病房继续治疗。

表4 FPIA法与HPLC法测定万古霉素标本的结果

2.5.2 FPIA法与HPLC法测定结果比较

标本来源为重庆医科大学附属儿童医院。利用SPSS统计软件分析，对数据进行两独立样本 t检验，分析结果认为，两总体的方差无显著差异。说明我院用HPLC法与重庆医科大学附属儿童医院FPIA法2种方法测定人血清中万古霉素的浓度的结果无显著性差异，表明我院建立的HPLC法测定万古霉素血药浓度方法可行。详见表4。

2.5.3 我院临床标本的测定

2016年11月至2017年3月，我科为ICU监测万古霉素血药浓度5次，测定结果见表5。

表5 我院临床ICU标本万古霉素测定结果

3 讨论

3.1 测定波长选择

将质量浓度为10 mg/L的万古霉素标准品溶液，以水作为空白对照在UV-2401PC型紫外分光光度计下进行扫描。结果，万古霉素在280 nm波长处有最大吸光度，有末端吸收；高效液相色谱法试验表明，280 nm处的吸收峰面积为205 nm波长处的吸收峰面积的1/7，故选择检测波长为205 nm。

3.2 流动相选择

曾考察了流动相系统中两种成分的不同比例对有效成分分离的影响，甲醇 -0.05 mol/L 磷酸二氢钾缓冲液（pH=2）的比例分别为16∶84和17∶83，等度洗脱。结果表明，两种流动相系统都能使万古霉素与杂质峰分开，但当甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH=3.2）的比例为17∶83时万古霉素有较好的分离，分离度为 1.900，拖尾因子为 1.052，tR为 14 min，故最终选择后者（17∶83）为流动相。

3.3 蛋白沉淀剂优化

选择4种蛋白沉淀剂考察沉淀蛋白的效果，分别为10%硫酸锌溶液、10%三氯醋酸溶液、10%高氯酸沉淀蛋白二氯甲烷萃取、10%三氯乙酸和乙腈（4∶1）。结果显示，10%硫酸锌溶液沉淀蛋白不完全，离心后上清液浑浊无法直接进样；10%三氯乙酸沉淀蛋白二氯甲烷萃取，处理血样时操作烦琐，二氯甲烷萃取离心后水层不宜吸出；10%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，离心后上清液澄清，但提取率只有33%，10%高氯酸和乙腈（4∶1）沉淀蛋白，离心后上清液澄清，提取率可达70%，所以最终选择10%三氯乙酸和乙腈（4∶1）作为血清蛋白沉淀剂。

3.4 研究价值

耳、肾毒性是万古霉素最严重的不良反应，其发生与血药浓度过高有关，临床应用时常通过监测血药浓度来降低耳、肾功能损害风险。HPLC法提取率高，重复性好，操作简便、灵敏，适用于临床患者使用万古霉素后的血药浓度测定。本研究使为患者进行个体化给药、优化给药方案和提高临床疗效成为可能。

[1]陈佰义，管向东，何礼贤，等.万古霉素临床应用中国专家共识（2011 版）[J].中国新药与临床杂志，2011，30（8）：561-573.

[2]王 华，许 静，钱南萍，等.微生物法测定血浆中万古霉素血药浓度的研究[J].现代医药卫生，2008，24（16）：2390-2391.

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[4]肖 力，任 斌，陈小陆.荧光偏振法测定去甲万古霉素血药浓度[J].齐齐哈尔医学院学报，2007，28（3）：315-316.

[5]张萌萌，史国兵，颜 鸣，等.LC-MS/MS法测定人血清中去甲万古霉素的血药浓度[J].中国药师，2013，16（7）：990-993.

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