连接组和连接组计划

顾凡及

复旦大学 生命科学学院，上海 200433

2012年韩裔美国神经科学家承现峻说了一句话：“你不只是你的基因组，你是你的连接组。”[1]从而使“连接组”这一术语名声大噪。连接组就是神经系统中所有神经细胞相互连接关系的总体。对于任何系统来说，要想了解其工作机制，认识其中元件的性质和元件之间的连接线路图和相互作用无疑是基础性的。你之所以是你，而不是别人，遗传所得的基因组固然决定了大方面，但是神经细胞之间的相互联系还需要通过后天的经历才能决定。所以每个人的脑都是独一无二的，即使同卵双胞胎的脑的连接组也不一样。这就是承现峻那句名言的意思。人脑中有900亿个神经细胞，它们彼此通过突触形成150万亿个连接。这样巨大的数目自然使得要搞清楚连接组变得令人望而生畏。由于近年来技术的飞速发展，科学家开始考虑这样做的可能性。对于人类来说，神经细胞的种类数要远远小于它们彼此之间的连接数(但是其确切数目我们依然不知道)，人脑的奇妙功能主要是由这些细胞的连接模式决定的，如果连接出了问题，就会表现出形形色色的脑疾患。因此，对神经细胞分类，特别是研究这些神经细胞是怎样彼此连接起来的，也就是画出神经细胞相互连接的“线路图”就成了脑科学研究的一个基础前沿课题。人们仿照基因组，把脑中甚至是整个神经系统中神经细胞相互连接的总体称为“连接组”(connectome)。研究连接组成了一门独立的分支——连接组学(connectomics)。

连接组学的研究可以在微观和宏观两个层次上进行：在宏观层次上，连接组学要确定所有皮层区以及与所有皮层下结构之间在功能上和结构上的连接；在微观层次上，连接组学要画出某个动物神经系统中所有神经细胞彼此之间相互联结的线路图。下面我们就按这两个层次展开讨论。

1 宏观连接组学研究和人类连接组计划

宏观连接组学的研究任务是确定几百个功能各异的脑区，认识这些脑区如何相互连接并由此产生种种行为，同时研究它们与各种神经疾病与精神疾病的联系。

新技术的开发从来都是科学发现的“助产士”。宏观连接组研究得益于下列4种磁共振成像技术(MRI)，使得研究者可以在无损伤的情况下观察人脑各脑区以及皮层下结构之间的解剖结构连接和功能连接：①结构磁共振成像(structural MRI)，可以给出脑结构的高分辨率图谱；②任务激发功能磁共振成像(task-activated functional MRI, tfMRI)，利用活动脑区血氧水平的变化检测活动脑区的技术；③扩散磁共振成像(diffusion MRI, dMRI)，根据水分子沿轴突扩散得出不同脑区之间的连接路径，这常被称为“结构性连接”(图1(a))；④静息态功能磁共振成像(resting-state fMRI, rfMRI)，不给受试者任何智力任务时检测到脑中同时激活或失活的区域，由此确定脑中哪些部位之间存在“功能性连接”(图1(b))。当前此类研究的一大挑战是如何把由这4种不同方法得到的信息整合起来，以及提高这些成像技术的空间和时间分辨率。

图1 用dMRI技术所得的人脑各区之间的连接通路(a)和用rfMRI所得的脑功能成像(b)(绿点代表目标点，浅色区域表示和目标点高度相关，深色区域表示和目标点很少相关，相关越高表示其间的功能联系越密切)[2]

为了研究正常青年人的宏观连接组，2009年美国国立卫生研究院(NIH)宣布对人类连接组计划(Human Connectome Project, HCP)公开招标，其研究目标是用非侵入性成像技术采集健康年轻成年人的脑回路和连接信息，并对此进行分析和共享。由此产生的大量数据将有助于研究诸如诵读困难、自闭症、阿尔茨海默病和精神分裂症等脑失常疾病[3]。

这一招标获得了全世界神经科学家的热烈响应。2010年9月15日NIH宣布最后有两个组中标。一个是华盛顿大学、明尼苏达大学和牛津大学的联合研究组(WU-Minn-Ox)，他们以神经生物学、神经信息学和神经成像分析见长，获得了3 000万美元的资助；另一个中标的是由麻省总医院和加利福尼亚大学洛杉矶分校组成的联合研究组(MGH-UCLA)，他们的目标是建立用于扩散成像的特殊设备，获得了1 000万美元的资助。此计划于2010年正式启动，2016年6月完成了其第一阶段研究。

这一可称之为“青年HCP”的计划在这6年中取得了下列成就：

(1)到2016年秋为止，对1 100名受试者中的每个受试者都用上述4种成像技术，每种技术采集1 h数据。在这些受试者中还特意收集了300个家庭中的同卵双胞胎、异卵双胞胎和非双胞胎兄弟姐妹的数据，由此研究遗传和后天经历对连接组的影响。

(2)在计划的前两年对成像技术和设备大力改进，以尽可能提高图像的空间分辨率和时间分辨率。

(3)尽量消除成像中的畸变、模糊和噪声。

(4)尽量保持脑结构的自然边界。对皮层来说要尽量真实地用二维图谱表示脑的三维结构。40年之前梵埃森(Van Essen)在研究猴视皮层时是用手工绘制的，而现在该计划中则用计算机自动生成。皮层下结构不成层状，而是体积较小的块状，因此开发了另外的算法来绘制。

(5)开发出新的算法来处理不同人脑，特别是皮层上的差异性，由此尽可能精确地矫正不同受试者图谱上的不同脑区。

(6)根据脑的解剖结构和功能对其作更精确的分区。在20世纪初，布洛德曼(Korbinian Brodmann)按照皮层的结构和细胞构成把皮层分成了52个不同的脑区，这一分区在很大程度上沿用至今。2008年格莱瑟(Matthew Glasser)加入梵埃森在华盛顿大学的实验室之后，他们两人用新的脑成像技术，根据皮层厚度、髓鞘情况、任务激活模式、功能连接性和通过rfMRI揭示的拓扑组织把每侧半球皮层都分成180个不同脑区，两侧高度对称(图2)。他们还开发出算法实现自动分区。这一工作对宏观尺度下的连接组研究具有基础重要性。不过格莱瑟指出这一分区并非最后结果，如果有更好的方法，也许对其中某些脑区还能作进一步的细分。

图2 人脑皮层的新分区[3]

(7)他们公开了自己的分析工具和数据，让整个神经科学界共享。到2016年秋，已经有超过6 000名研究人员签署了HCP数据使用协议，并下载了超过10 PB(10 000 TB)的数据。据此发表了140多篇论文，这个数量还在迅速上升中。

在正常青年连接组计划之后，下一阶段将把目标扩大到所有年龄段(特别是发育阶段和衰老阶段)，这被称为生命期人类连接组计划(Lifespan Human Connectome Projects)，其中包括：发育期计划(Lifespan Development Project)，研究1 300名年龄在5～21岁的受试者；衰老期计划(Lifespan Aging Project)，研究1 200名36岁以上的受试者；婴儿期连接组计划(Lifespan Baby Connectome Project)，研究300名从出生到5岁的儿童。另一个方面就是聚焦各种脑疾患的许多连接组计划。这样的计划在10个以上，包括精神分裂症、阿尔茨海默病等。这些计划通过公共平台“连接组协调机构(Connectome Coordination Facility, CCF)”实现数据共享(http://humanconnectome.org/ccf)。

这些计划将为大科学(big science)或者团队科学(team science)提供合适的用武之地。并为今后若干年的神经科学研究留下一个基础数据的宝库。

2 微观连接组学研究

微观连接组学的研究目标是要绘制出神经系统中各个神经细胞是如何相互连接的，并以此来解释行为。由于这类研究的主要手段是侵入性的，所以目前主要是动物实验。

粗看起来，要找出动物神经系统中神经细胞的相互连接似乎并不难，我们早就有了对神经细胞的切片、染色和显微镜(包括电子显微镜)观察技术，还有示踪物追踪和损伤退行性变化的追踪技术。即使稍大一点的动物，其神经系统内部的神经细胞十分密集，神经细胞轴突相对于其细胞体的大小来说可以在三维空间中延伸很远，因此并不容易追踪。幸而近年来发展起自动连续切片、显微图像自动采集和自动识别以及三维重建的技术，大大提高了追踪的效率。这些技术的进一步改进，也是现在许多实验室的研究重点。

到目前为止，在微观层次上成功构造出整个神经系统中所有神经细胞相互连接的线路图的唯一动物是一种称为秀丽隐杆线虫(C. elegans)的小虫(图3)，它的整个神经系统中只有302个神经细胞，其中每个细胞都有特定的部位和形状，可以一一命名。但是它有100多种不同的神经细胞，因此这种小虫的神经系统虽然“简单”，但是对其功能的机制至今还没有完全搞清楚。由此可以想象要绘制出有900亿个神经细胞和150万亿个突触连接的人脑微观连接组图谱，并由此解释人类行为该有多困难[1]！所以科学家在当前把目标放在神经系统比秀丽隐杆线虫要大得多，但是其中神经细胞的数目依然远远小于人脑的动物，如果蝇幼虫(它的脑中有15 000个神经细胞，可以产生30种不同的动作)、斑马鱼幼鱼(有100 000个神经细胞)，而且往往还只限于局部神经部位的连接组(如对有135 000个神经细胞的果蝇成虫的脑，就只研究其中嗅小球的连接组，另外如小鼠视网膜和初级视皮层中的连接组图谱)。

图3 长度大约1 mm的秀丽隐杆线虫放大图(图片来自维基百科)

图4显示了美国神经科学家茨莱铁克(Marta Zlatic)和卡多纳(Albert Cardona)夫妇对果蝇幼虫研究过程的示意图。图中自上而下，依次显示对果蝇幼虫脑作连续切片；根据这些切片进行三维重建；从三维重建图中画出脑内线路图；两个功能特异的线路，左面的线路在幼虫头部受到气流吹动时负责偏转头的方向，右面的线路则使头回缩；最下面的图是幼虫的动作图解。现在以他们为核心已经组织起全球20个实验室协作攻关，他们期望在今后两三年内就能把果蝇幼虫脑的连接组搞清楚。最近康斯泰茨大学(University of Konstanz)的科学家们重建了其蘑菇体中8 000个神经细胞的连接组(蘑菇体是记忆中心)，这无疑是对此项研究的一个突破性贡献。

在微观连接组研究中，果蝇之所以特别受到重视在于：①果蝇的脑中大约有13 500个神经细胞，因此有望在可预见的将来研究清楚其连接组；②果蝇的脑虽然很小，但是它依然能表现出好几百种相当复杂的行为，对这些行为已经有许多研究者研究多年；③对果蝇的遗传特性已经研究得相当清楚；④对果蝇的电生理学、钙成像等研究也早已进行多年。目前已经有了果蝇全脑的宏观连接组，在微观连接组方面则已有了其视觉系统中两个部分的详细连接组线路图。

对人脑来说，要在现在就能绘制出像果蝇幼虫脑这样的线路图显然是不现实的，但是英国剑桥大学和德国、加拿大的研究人员花了10年时间把一位65岁去世的老妇的脑切成7 400片薄片，并按此进行三维重建，从而得到了一个很详细的数字脑。这就像是给科学家一个有关脑的谷歌地图，由此可以在各种精度下观察脑的结构。

图4 对果蝇幼虫进行连接组研究的示意图[4](图中自上而下，依次显示对果蝇幼虫脑作连续切片；根据这些切片进行三维重建；从三维重建图中画出脑内线路图；两个功能特异的线路，左面的线路在幼虫头部受到气流吹动时负责偏转头的方向，右面的线路则使头回缩；最下面的图是幼虫的动作图解)

3 艾伦脑科学研究所

艾伦脑科学研究所(The Allen Institute for Brain Science)是由微软的共同创始人艾伦(Paul Allen)夫妇在2003年出资建立的。他们的成果向全世界脑科学界免费开放。从2011年开始，该所的研究方向除了从创立开始就一直在进行的脑基因表达图谱之外，开始了和连接组研究关系密切的两个计划：一个是在2011年11月启动的“艾伦鼠脑连接图谱(Allen Mouse Brain Connectivity Atlas)”，其目的是绘制鼠脑中神经连接的高分辨率三维图谱；另一个是2015年启动的艾伦细胞类型数据库(The Allen Cell Types Database)，第一批公布的是有关鼠脑视皮层中240种神经细胞类型，当然人脑中的神经细胞类型要比这多得多，这是该项目的远期目标，他们把这一工作和元素周期表相比拟。

不仅如此，2016年7月艾伦脑科学研究所又发布消息，报道已启动4年之久的“艾伦脑观察站(Allen Brain Observatory)”的成果[5]。该项目的目的是观察当鼠在接受各种视觉刺激时，其视皮层中的大群神经细胞是怎样同时活动的(图5)。这些刺激形式包括鼠所处的环境景象，甚至放映一段好莱坞影片《历劫佳人》(Touch of Evil)。之所以选取这一电影是因为在电影开头3分钟内没有任何剪切而接近真实生活中的经历，并且有各种不同的运动方向。做实验的小鼠经过专门的基因修饰，使其神经细胞在发放时同时产生荧光。这样实验者就可以通过经手术在其颅骨上开的小窗分层观察小鼠在看录像时，哪些细胞发光？这些细胞在什么部位？发光多长时间？此时小鼠有什么动作？当时屏幕上显示的是什么？他们公布了25只小鼠视皮层4个脑区中的18 000个神经细胞在360次实验中所得到的结果(2017年6月他们公布的新数据包括40 000个神经细胞)。参加这一工作的神经科学家德里斯(Saskia de Vries)声称：“这是有史以来在细胞水平上实时观察到大群神经细胞活动的第一批数据。”

图5 给小鼠看各种静止图像时，记录其视皮层中某个特定细胞反应所得的辐射状数据图(给小鼠看各种静止图片一定次数，辐射线的长度表示该细胞对特定图片刺激的反应强度。由图可见，这个细胞对蝴蝶反应最强，虽然看两张蝴蝶图片的视角很不一样)

他们的一个有趣发现是当给动物看动物图片和《历劫佳人》片段时，神经细胞的反应模式有更好的重复性。德里斯声称：“我们把这段影片放了10次，发现每次放映时都有许多细胞在某个时刻有反应，这是一些可靠、可重复和鲁棒的反应。”他们的这些数据也都对外公开。到目前为止，他们的实验还只限于让小鼠观看屏幕，以后他们还要训练小鼠按照它之所见执行种种任务，希望由此得以研究记忆、决策和问题求解。艾伦脑科学研究所所长科赫(Christof Koch)说道：“如果我们想认识脑的高级功能，那么单单认识脑的个别成分是不够的，还需要认识它们怎么协同工作，艾伦脑观察站提供极为重要的资源以认识单个神经元(知觉的原子)怎样一起工作，从而产生体验的最深层也最有意义的方面。”

综上所述，艾伦脑科学研究所的工作不仅涉及到微观连接组以及神经细胞分类的基础研究，而且还涉及到大群神经细胞的同时活动，并把这些活动和动物的行为联系起来，而这也正是美国脑计划——BRAIN创议的主要目标之一。艾伦脑科学研究所也是该计划的成员单位。

4 大科学、梯队科学和公开科学

值得一提的是艾伦脑科学研究所的运作方式，科赫把这种方式总结为“大科学、梯队科学和公开科学(open science)”[6]。也就是说该所环绕某些大的科学目标，以工业方式组织各种专门人才分工合作进行攻关，并把数据和分析工具公之于众。这种方式对于像大规模神经细胞分类，绘制连接组图谱这样工作量巨大，有相当重复性的工作是非常有效的，但是对于需要高度创造性的研究是否可行还值得研究。

最近在这方面的研究又有了新进展。华中科技大学在苏州建立了一个华中科技大学苏州脑空间信息研究院，和艾伦脑科学研究所、冷泉港实验室、斯坦福大学的研究者展开合作。该院拥有50套自动化的成像系统，对小鼠全脑进行自动切片、高分辨率成像和三维重建(图6)。来自艾伦脑科学研究所的曾红葵声称：“以工业化的形式大规模、标准化地产生数据将改变神经科学已有的研究方式。”这样做的结果将产生海量数据，他们现在正努力提高速度并采用多套成像系统并行工作[7]。

图6 鼠脑三维重建的部分结果[7]

5 结语

你之所以为你，主要是因为你的脑。脑作为一个物理系统，其性质取决于其中的元件和元件之间的相互作用，这样的思想并无大错。因此承现峻才说你是你的连接组。研究连接组对于了解人类自己，以及防治脑疾患也就有着极大的重要性。不过承现峻也很清楚地认识到他的那句话只是大体上说的。现在有些人认为既然如此，就可以把连接组存储到计算机中去，也就是所谓的“上传心智”，这样就可以实现永生。承现峻对此并不认同[1]。这是因为我们的心智并不是静态的，它是脑和环境相互作用的动态过程。更为重要的是脑中的元件并不只限于神经细胞，还有数量超过其10倍的神经胶质细胞，而现在的连接组中并没有考虑在内。另外，神经细胞和神经细胞之间的相互作用也不限于相邻神经细胞之间的直接作用，还有许多化学物质——神经递质和神经调质可以扩散到突触之外影响远处神经细胞的工作。这也是现在的连接组所没有考虑在内的。所以承现峻说，如果要说得更确切一些，那么应该说：“你是你的脑”。不过这就成了老生常谈了。另外，最近的研究表明内脏对脑也有影响，所以要说得更完整，也许就得说：“你是你的整个人。”不过这就近于废话了。所以他告诫读者，人还是要死的，包括他自己在内。确实，即使是真理，无限外推也会变成谬论。

[1]承现峻, 著. 连接组: 造就独一无二的你[M]. 孙天齐, 译. 北京: 华大学出版社, 2015.

[2]BARDIN J. Making connections [J]. Nature, 2012, 483: 394-396.

[3]VAN ESSEN D C, GLASSER M F. The human connectome project:progress and prospects [EB/OL]. (2016-12-13) [2017-08-20]. http://www.dana.org/Cerebrum/2016/The_Human_Connectome_Project__Progress_and_Prospects/.

[4]SMITH K. The brain-circuit challenge [J]. Nature, 2017, 548: 150-152.

[5]SHEN H. Brain-data gold mine released [J]. Nature, 2016, 535: 209-210.

[6]KOCH C, JONES A. Big science, team science, and open science for neuroscience [J]. Neuron, 2016, 92(2): 612-616.

[7]CYRANOSKI D. China launches brain-imaging factory [J]. Nature,2017, 548: 268-269.