UPLC-MS/MS法检测唾液中的奥沙西泮

吴东星，李树华，李继印，任国印，曾思火，李 虹

随着滥用药物逐渐成为世界性的社会问题，体内滥用药物分析向法庭科学领域、毒物分析领域提出了新的任务和要求。目前，国内对滥用药物检测的方法有：气相色谱—质谱联用(gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS)法[2-4]、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法[5-8]和超高效液相色谱—串联质谱(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法[9-13]，多用以检测人体血液、尿液，而对唾液检测的文献报道较少。因此，本研究用UPLC-MS/MS法对人体唾液中奥沙西泮(oxazepam)进行了检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器超高效液相色谱—串联质谱联用仪：AgiLent1290型超高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司，德国)和AB SCIEX 4000Q TRAP 串联质谱仪(AB SCIEX公司，新加坡)，配Analyst® software工作站；AllegraTM X-22台式高速离心机(贝克曼库尔特公司，美国)。

1.2标准品与试剂奥沙西泮购自公安部物证鉴定中心，纯度≥98%；乙腈、甲醇试剂为色谱纯，甲酸、氨水试剂为分析纯，实验用水为去离子水。

1.3实验样品65份唾液样品均采自口服奥沙西泮1片(每片15 mg)后30 min 至12 h的5名志愿者。

1.4色谱条件ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流动相0.1%甲酸水溶液—乙腈梯度洗脱，洗脱程序见图1；进样体积5 μL，流速0.4 mL·min-1，运行时间6 min，柱温35 ℃。

1.5质谱条件采用电喷雾离子源(electron spray ionization,ESI)，分析物在正离子扫描下检测；三重四极杆检测器；毛细管电压为5.5 kV；去溶剂气温度550 ℃，去溶剂气流量：800 L·h-1；锥孔气流量30 L·h-1；碰撞气流量：0.15 mL·min-1，锥孔电压80/12，碰撞电压30/13。奥沙西泮的监测离子为287.0/241.0、287.0/165.0和287.0/104.0。

1.6样品前处理用甲醇稀释唾液至一定倍数，经振荡器振荡3 min，在15 000 r·min-1转速下离心3 min，取上清液过有机滤膜(13 mm×0.22 μm)后供检。

1.7标准工作液的配制精密称量10.0 mg奥沙西泮标准品于10 mL容量瓶内，用甲醇稀释至刻度线，振摇均匀得到1.0 mg·mL-1奥沙西泮标准液，置4 ℃冰箱保存。取空白唾液，按1.6节方法处理后，取适量上清液按浓度梯度逐次稀释1.0 mg·mL-1奥沙西泮标准液成浓度分别为100、50、20、10、5和1 ng·mL-1的线性工作溶液，置4 ℃冰箱保存、待测。

2 结果

2.1系统适应性试验在1.4和1.5分析条件下，分别对空白对照、质控样品(10 ng·mL-1)和唾液样品检测，以287.0/241.0、287.0/165.0和287.0/104.0这3对离子对和保留时间(Rt=2.24 min)进行定性分析，并与已知奥沙西泮标准物质进行比对，空白对照无干扰。进样结果表明：UPLC-MS/MS检测方法专属性好，见图1。

图1 不同样品中奥沙西泮的定量离子对色谱图

2.2流动相的考察本文分别用流动相为0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%氨水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液对质控样品进行梯度洗脱，进样结果表明：奥沙西泮在流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液中响应度较高。因此，本文选用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.3提取溶剂的考察本文分别用乙腈、甲醇试剂对唾液样品进行前处理，经UPLC-MS/MS检测分析表明：用甲醇作为提取溶剂时，奥沙西泮具有良好的色谱峰。

2.4线性范围、检出限和定量限取浓度分别为1、5、10、20、50和100 ng·mL-1的奥沙西泮标准溶液，在1.4和1.5节条件下测定；以定量离子(287.0/241.0)峰面积A为纵坐标，质量浓度C为横坐标，绘制奥沙西泮的标准曲线，求得标准曲线的回归方程和相关系数。以线性最低点溶液逐倍稀释后，以信噪比>3为检出限，以信噪比>10为定量限。奥沙西泮的线性方程、检出限和定量限见表1。

表1 奥沙西泮的线性方程、检出限和定量限 ng·mL-1

2.5回收率、基质效应和精密度分别配制5、50、90 ng·mL-1奥沙西泮标准溶液各6份，按1.6节方法处理后，在1.4和1.5节条件下测定，每日进样5次，每次间隔2 h，记录峰面积As，计算日内精密度(relative standard deviation,RSD)表示；每份样分别连续测定3 d，计算日间精密度用相对标准偏差。取空白唾液18份，分别加入浓度为5、50、90 ng·mL-1的奥沙西泮标准溶液1 mL，配置成实际添加含量分别5、50、90 ng的空白添加系列样本为各6份，按1.6节方法处理后，在1.4和1.5节条件下测定，记录峰面积为Am。将所测得的Am数据代入奥沙西泮标准曲线方程，并计算测得值，以测得值与实际添加量对比，计算提取回收率。另取上述3个浓度的标准溶液，在1.4和1.5节条件下直接进样测定，记录峰面积为Astd，以Am/Astd计算基质效应，结果见表2。

表2 奥沙西泮的回收率、基质效应、准确度、精密度和稳定性

注：RSD：相对标准偏差。

2.6稳定性配制低、中、高3个浓度的质控样品(n=3)，于室温放置24 h及经过3次冻融循环后，按1.6节方法处理质控样品浓度为5、50、90 ng·mL-1的溶液，并在1.4和1.5节条件下测定，考察其短期稳定性及冻融稳定性。结果表明，奥沙西泮在上述条件下均稳定(见表4)。

2.7样品测定采集5位志愿者的65份唾液，按1.4节方法处理后，在1.4和1.5节条件下测定。65份唾液中，全部检出奥沙西泮，其中定量数为57份，8份只能定性，结果见表3。

3 讨论

本研究建立了唾液中奥沙西泮的UPLC-MS/MS的检测方法。实验结果表明：唾液样品经甲醇蛋白沉淀后，以流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液对奥沙西泮进行梯度洗脱，以电喷雾离子源正离子多反应监测模式进行质谱分析，并通过多个特征离子对和保留时间对唾液中奥沙西泮进行定性分析。用UPLC-MS/MS法检测唾液中的奥沙西泮，该检测方法提取回收率高，大于90%；基质效应低，唾液样品无需加酶水解，样品前处理简便；检测方法灵敏度高，检出限低于0.1 ng·mL-1，准确度高。

表3 唾液样品中奥沙西泮的检测结果 ng·mL-1

5名志愿者65份唾液样品中均检出奥沙西泮成分，其中57份唾液样品中奥沙西泮的含量高于定量限，8份仅能定性分析，研究表明：在人服用奥沙西泮12 h内，唾液中仍可检出一定量的奥沙西泮，且含量相对稳定。因此，可以选取唾液样品作为生物样品中奥沙西泮的检材，为体内滥用精神活性药物检测提供了一个有效的分析方法。

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