丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马iNOS及MG表达的影响

冯 涛 杨霄鹏

1)南阳医学高等专科学校第一附属医院神经内科，河南 南阳 473058 2)郑州大学第二附属医院神经内科，河南 郑州 450014

随着老龄社会的到来，慢性脑缺血(chronic cerebral ischemia，CCI)伴发的Alzheimer’s病(Alzheimer’s disease，AD)、血管性痴呆(vascular dementia，VD)等多种脑血管疾病受到社会的广泛关注，已成为社会问题。近些年来对慢性脑缺血导致的脑损伤机制及防治研究较少。在慢性脑缺血的病理过程中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达增多，加速钠离子内流，是脑损伤的重要机制[1]。小胶质细胞(MG)是颅内重要的免疫炎症细胞，参与慢性脑缺血病理损伤过程。本研究采用双侧大鼠颈总动脉永久结扎的方法制作大鼠慢性脑缺血模型，观察慢性脑缺血对大鼠学习记忆能力、海马区iNOS、OX42表达及神经元数目及给予丁苯酞干预后对上述指标的影响，探讨丁苯酞的脑保护机制。

1 材料

1．1动物及分组挑选雄性健康SD大鼠48只，清洁级，体质量(210±20)g，郑州大学医学院实验动物中心供。实验SD大鼠在造慢性脑缺血模型前3d带回实验室。避免刺激，实验室温度保持21～26 ℃，湿度适宜。自由进食水。随机将60只SD大鼠均分4组：正常大鼠组为A组、假模型组为B组、模型组为C组、丁苯酞干预组为D组，每组12只，造慢性脑缺血模型前12 h禁食水。

1．2药物与试剂iNOS抗体、Ox42(MG的标志)抗体、SP9001试剂盒、DAB试剂盒购于北京中杉生物工程公司。多聚甲醛由天津市科密欧化学试剂有限公司提供。磷酸二氢钠由汕头市光华化学厂提供。Y型电迷宫(张家港市生物医学仪器厂)。采用德国Lecia显微照像系统采集图像，应用日本奥林巴斯光学显微镜。丁苯酞软胶囊(恩必普，石药集团恩必普药业有限公司)，规格：0.1 g/丸，生产批号：H20050299。

2 方法

2．1制备模型采用永久性结扎双侧颈总动脉建立慢性脑缺血大鼠模型[2]。采用10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉。造模前常规局部备皮、消毒，颈部正中切口，切开皮肤，切口约1.6 cm，分离皮下组织，可见双侧颈总动脉伴行迷走神经，暴露双侧颈总动脉，将其与迷走神经钝性分离，将双侧颈总动脉近心端及远心端分别结扎后在结扎之间断离双侧颈总动脉，局部止血，缝合皮肤，如大鼠自然醒来说明慢性脑缺血模型成功，模型失败的大鼠等量补齐。假模型组大鼠除不结扎断离双侧颈总动脉外，同模型组。

2．2动物处理正常大鼠组、假手术及模型组大鼠给予生理盐水2 mL灌胃，1次/d。丁苯酞干预组在造模型成功后给予丁苯酞软胶囊0.2 g·kg-1治疗12周。各组大鼠实验结束用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射深度麻醉，从左心室加压300 mL生理盐水快速灌洗、灌注，4%多聚甲醛溶液心内灌注固定60 min后取脑，4%多聚甲醛液固定24 h，脱水，浸蜡，石蜡包埋，制石蜡冠状切片(厚度4 μm)。

2．3指标检测

2．3．1 Y电迷宫测试：学习记忆能力测试方法采用Y电迷宫方法，将大鼠置入安静暗室内进行主动逃离学习记忆能力测试。Y电迷宫内有无电流刺激的安全区和有50～70 V交流电的刺激区，无规则反复变换安全区和电刺激区，观察大鼠逃离电刺激区进入安全区的能力。以大鼠顺利到达安全区的电击次数为学习成绩，电击次数越少表明学习记忆能力强。

2．3．2 免疫组织化学染色(SP法)步骤：采用二甲苯对石蜡冠状切片进行脱蜡2次，酒精脱蜡2次，蒸馏水清洗2次，柠檬酸修复液高温修复，低温维持，室温冷却。采用3% H2O2去离子水孵育，PBS液冲洗后滴加山羊血清封闭液，采用内源性生物素进行封闭。滴加一抗OX42抗体(1∶100稀释)4 ℃过夜。室温复温，PBS液冲洗，滴生物素二抗工作液，PBS液冲洗后滴辣根酶液，孵育，PBS液冲洗后神经元呈蓝色剂，苏木素复染，水冲洗后混合液脱色，采用低到高浓度酒精脱水、封片。高倍镜(400×)下对大鼠海马区iNOS、MG进行观测，阳性细胞呈现棕黄色染色改变，采集图像，分析阳性区平均积分光密度值。

2．3．3 尼氏染色方法：石蜡冠状切片先脱蜡，采用1%甲苯胺蓝在室温10 min后90%乙醇脱色30 s，无水乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片，神经元呈蓝色为尼氏染色阳性细胞，高倍镜(400×)下观测计数海马区神经元阳性细胞。

3 结果

3．1大鼠Y电迷宫测试A、B组大鼠精神正常，反应灵敏，电迷宫训练达标次数正常。C、D组大鼠表现为精神差，萎靡不振，反应迟钝，电迷宫训练达标次数明显多于A、B组(P<0.01)。D组大鼠电迷宫训练达标次数明显少于C组(P<0.01)。见表1。

3．2大鼠海马区iNOS、OX42的表达A、B组大鼠海马区iNOS有表达不明显，C、D组大鼠海马区iNOS表达明显增多，多于A、B组(P<0.01)。D组大鼠海马区iNOS表达较C组明显下降(P<0.01)。A、B组大鼠海马区OX42有表达不明显，C、D组大鼠海马区OX42表达增多，明显高于A、B组(P<0.01)。D组大鼠海马区OX42表达较C组明显下降(P<0.01)。见表2。

表1 4组大鼠Y电迷宫测试±s，n=12)

注：与A、B相比，1)P<0.01；与C组相比，2)P<0.01

表2 4组大鼠海马区iNOS、OX42表达±s，n=12)

注：与A、B相比，1)P<0.01；与C组相比，2)P<0.01

3．3大鼠海马区神经元计数A、B组大鼠海马区经尼氏染色呈阳性神经元计数(70.89±4.28个)，如图1、2所示。C组大鼠海马区经尼氏染色呈阳性神经元计数(19.17±3.04个)，如图3所示。D组大鼠海马区经尼氏染色呈阳性神经元计数(38.12±4.11个)，如图4所示。C、D组大鼠海马区神经元计数明显低于A、B组(P<0.01)，D组大鼠海马区神经元计数较C组明显增多(P<0.01)。见表4。

表3 4组大鼠海马区神经元尼氏染色±s，n=12，个/400倍视野)

注：与A、B相比，1)P<0.01；与C组相比，2)P<0.01

图1 A组大鼠海马区神经元尼氏染色(×400) 图2 B组大鼠海马区神经元尼氏染色(×400)

图3 C组大鼠海马区神经元尼氏染色(×400) 图4 D组大鼠海马区神经元尼氏染色(×400)

4 讨论

慢性脑缺血是慢性脑白质变性和老年性痴呆的重要病理生理因素[3]，抑郁是慢性脑缺血后常见并发症，国内报道发生率20%～40%[4]，国外报道发生率40%～60%[5]。长期慢性脑缺血抑制神经元胞浆在细胞内定向流动，降低新陈代谢，导致颅内血液和淋巴循环障碍，蛋白合成率下降，抑制神经再生等[6]，慢性脑缺血导致过度炎症免疫反应加剧氧自由基生成，兴奋性氨基酸毒性作用及细胞内钙离子超载等病理损伤等过程[7-8]。

iNOS是存在人体巨噬细胞内一种重要的合酶[9]，为非钙离子依赖性，一般生理状态不表达，在慢性脑缺血损伤时，iNOS逐渐表达，主要分布在神经细胞、炎性细胞、神经胶质细胞，颅内海马部位表达最明显[10]。一旦诱导合成，就持续大量产生一氧化氮(NO)。NO具有扩张脑血管、调节血压及脑血流等作用，大量产生的NO与阴离子结合形成过氧化亚硝酸盐(ONOO-)和羟自由基(OH-)，导致大量钠离子和氯离子转移至细胞内，发生神经细胞水肿，抑制线粒体呼吸，损伤细胞膜，诱导缺血区神经元凋亡[10-11]。iNOS是慢性脑缺血产生过量NO的基础，是脑慢性缺血损伤的一个重要原因。文献[12]报道，激活的MG是iNOS的主要来源。

MG广泛分布在颅内，兼有神经保护和神经毒性免疫细胞，是炎症免疫的标志[13-18]。慢性脑缺血时MG大量激活，引起血管内皮细胞通透性增高，加重缺血区缺血缺氧，导致更多的氧自由基、缩血管物质生成等，使缺血坏死区范围扩大[19-22]。所以，抑制慢性脑缺血过程中炎症反应，抑制MG过度激活，可以减少iNOS过度表达，保护神经元，减轻慢性脑缺血损伤程度，成为临床上治疗慢性脑缺血新的治疗方法[23-28]。颅内海马区血流丰富，对缺血缺氧耐受力差，是慢性脑缺血最敏感区，为MG主要分布区，为临床观察慢性脑缺血的最佳部位[29-35]。同型半胱氨酸已成为慢性脑缺血的独立危险因素，在慢性脑缺血早期血清同型半胱氨酸水平会明显升高，与MG水平呈负相关性，补充叶酸、维生素B6和维生素B12可安全降低同型半胱氨酸水平[17]，可以抑制MG的过度激活。

丁苯酞是在我国第一个拥有自主知识产权治疗缺血性脑血管病的药物，已广泛应用到缺血性脑卒中的治疗中，取得良好疗效。丁苯酞具有明显的抗缺血、减少脑缺血梗死面积、减轻脑水肿程度，同时具有开放脑缺血区域的微循环，加速侧支循环形成、保护线粒体及抗血小板聚集等作用[18-22，36-40]。同时，丁苯酞可以降低血清Cys C水平，减轻血管内皮损伤程度[23-24，41-45]，抑制兴奋性氨基酸的大量生成，减少钙离子超载及凋亡基因的大量产生等相关[25-29，46-51]。

本研究显示，丁苯酞能明显提高大鼠的学习记忆能力，抑制海马区iNOS、MG的过度表达，减少神经毒性因子分泌，抑制慢性脑缺氧大鼠海马区神经细胞的过度凋亡，具有明显的脑保护作用，为临床上应用丁苯酞提供理论依据。本研究还存在对动脉模型观察时间短，样本量偏少，不能完全反映慢性脑缺血过程中各项指标的演变过程；另外，海马区比较弥散，故取材定位缺血区与实际缺血可能有差距等不足之处。

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