枸橼酸碘溶液对4种病原菌的载体消毒效果研究

李亚菲，曾振灵，梁先明，谭志坚，贾 谏

(1.华南农业大学兽医学院，广州 510642；2.广东省农业科学院农产品公共监测中心，广州 510640；3.中国兽医药品监察所，北京 100081；4.佛山市正典生物技术有限公司，广东佛山 528138)

现代化养殖业中，养殖场使用消毒剂净化畜禽生长环境、消除病原微生物、减少病原菌的入侵、阻止疾病的引入和传播，从而预防和控制畜禽传染病的发生[1-3]。科学选择和合理使用消毒剂，对于做好养殖场的消毒净化工作以及疫病的预防、控制、扑灭起到至关重要的作用[4]。碘类化合物作为消毒剂的一种，已广泛应用于生产，其作用原理是通过氧化、碘代反应破坏细胞结构和酶系统等，从而达到杀菌目的[5-6]。有研究表明，柠檬酸作为一种弱有机酸，也具有一定的抗菌作用[7]。将两者制成复方消毒剂，克服了含碘消毒剂不稳定、易受环境酸碱性影响且容易产生刺激性和腐蚀性等缺点，以期达到高效、广谱、低毒的特点。我国农业部1992年颁布了《兽用消毒剂鉴定技术规范》，详细介绍了评价兽用消毒剂的试验方法。试验方法与卫生部颁布的《消毒技术规范》相似，包括对细菌、芽孢、病毒作用效果的试验方法。根据以上标准，本研究评价复方枸橼酸碘溶液对4种病原菌的消毒效果，同时选择国外产品百胜-30溶液作为对照，进行载体消毒试验，以期为该药在临床的应用提供依据和参考。

1 材 料

1.1 供试药品 枸橼酸碘溶液：含碘2.0%，佛山正典生物技术有限公司生产，批号1211070。百胜-30溶液：含碘3.0%，英国Evans生产，批号14744。

1.2 供试菌株 大肠杆菌8099、金黄色葡萄球菌ATCC6538、马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC556、蜡样芽孢杆菌8008，均为专用消毒剂鉴定菌种，购自中国兽医药品监察所。

1.3 主要试剂 营养肉汤、营养琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤、胰蛋白胨大豆琼脂，购自广州环凯微生物科技有限公司，新生小牛血清购自北京普博欣生物科技有限公司，无菌脱纤维绵羊血购自广州蕊特生物有限公司，其他分析纯试剂磷酸氢二钠、氯化钠购自广州化学试剂厂，无水氯化钙和氯化镁购自天津市科密欧化学试剂有限公司，磷酸二氢钾购自成都市科龙化工试剂厂，吐温-80购自天津市化学试剂三厂，硫代硫酸钠购自天津市大茂化学试剂厂。

1.4 主要仪器 微量移液器：法国吉尔森公司；超净工作台：苏州净化设备有限公司；SN510C高压灭菌锅：日本YAMATO公司；FA2004N型电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；数显隔热式培养箱：上海锦屏仪器仪表有限公司通州公司；HZQ-F160全温振荡培养箱：扬州市培英实验仪器有限公司；涡旋混合器：德国IKA公司；电子计时器：杭州精诚三合实业有限公司；显微镜：日本OLYMPUS公司。

1.5 溶液配制 标准硬水(硬度342 mg/L)：无水氯化钙0.304 g，氯化镁0.139 g，蒸馏水加至1000 mL，121 ℃灭菌20 min即可。磷酸盐缓冲溶液(0.03 mol/L，pH 7.2)：十二水合磷酸氢二钠7.13 g，磷酸二氢钾1.36 g，蒸馏水加至1000 mL，121 ℃灭菌20 min即可。

2 试验方法

载体消毒试验方法，根据试验指导原则进行[8]。

2.1 菌种的制备

2.1.1 细菌繁殖体悬液的制备 取冻干菌种管，在无菌操作下打开，加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。接种菌悬液于合适的液体培养基，置37 ℃培养18～24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于合适的固体培养基平板上，于37 ℃培养 18～24 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于合适的固体培养基平板上，于37 ℃培养18～24 h，即为第3代培养物。取第3～14代的固体培养基平板上的新鲜培养物(18～24 h)进行试验。将上述经传代后的菌种接种到合适的液体培养基，37 ℃培养18～24 h即得到细菌悬液。悬液应当天使用不得过夜。

2.1.2 细菌芽孢悬液的制备 取冻干菌种管，在无菌操作下打开，加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。接种菌悬液于合适的液体培养基，置37 ℃培养18～24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于合适的固体培养基平板上，于37 ℃培养 18～24 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于合适的固体培养基平板上，于37 ℃培养5～7 d后挑取少许菌苔作芽孢染色镜检。当每个视野内的芽孢数达90%～95%以上时，可收集芽孢。

芽孢染色方法：①用接种环蘸取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。然后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的 5.0% 孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54～56 ℃ 条件下，加热 30 min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5% 沙黄水溶液，染1 min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。

芽孢收集方法：在无菌操作下于琼脂培养基平板中加入4.0 mL无菌蒸馏水，使其浸润菌苔，再以涂布棒轻轻推刮下菌苔(小心勿将琼脂刮破)。吸取第1批洗下的菌悬液于无菌离心管中，再加4.0 mL无菌蒸馏水重复洗一遍。将第1和第2批洗下的菌悬液集中于一个无菌离心管内，以3000 r/min速度离心10 min。弃上清液，加入少量无菌蒸馏水悬浮菌体，再离心，如此重复3次。最后将浓缩的芽孢悬液置于80 ℃水浴中 10 min，以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4 ℃冰箱中备用。芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。

2.2 中和剂筛选实验 以大肠杆菌8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538为指示菌。中和剂拟采用含硫代硫酸钠、吐温-80的营养肉汤，使用前高压灭菌。消毒剂用无菌硬水稀释为一定浓度，稀释液用0.03 mol/L的无菌磷酸盐缓冲液。试验按以下分组进行：第一组：消毒剂+菌悬液。吸取1.0 mL试验菌悬液与4.0 mL消毒剂于试管内，涡旋20 s，混匀。作用至预定时间，吸此样液0.5 mL加于含有4.5 mL稀释液的试管中，混匀。吸取该最终样液0.1 mL涂布于琼脂平皿中，置37 ℃培养计数。第二组：(消毒剂+菌悬液)+中和剂。吸取1.0 mL试验菌悬液与4.0 mL消毒剂试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液0.5 mL加于含4.5 mL中和剂溶液试管中，涡旋20 s，混匀，作用10 min。吸取该最终样液0.1 mL涂布于琼脂平皿中，置37 ℃培养计数。第三组：中和剂+菌悬液。吸取0.1mL试验菌悬液与4.9 mL中和剂于试管内，涡旋20 s，混匀，作用10 min。吸取该最终样液0.5 mL，用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取0.1 mL涂布于琼脂平皿中，置37 ℃培养计数。第四组：中和产物+菌悬液。吸取0.1 mL试验菌悬液与4.9 mL中和产物溶液(以0.4 mL消毒剂加4.5 mL中和剂，作用10 min 配制而成)于试管内，混匀。作用10 min，吸取该最终样液0.5 mL，用中和产物溶液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取0.1 mL涂布于琼脂平皿中，置37 ℃培养计数。第五组：稀释液+菌悬液。吸取0.1mL试验菌悬液与4.9 mL稀释液于试管内，作用10 min。吸取该最终样液0.5 mL，用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取0.1 mL涂布于琼脂平皿中，置37 ℃培养计数。第六组：空白对照组。分别取中和剂、稀释液、无菌硬水0.1 mL涂布于琼脂平皿中，置37 ℃培养计数。

2.3 载体消毒实验

2.3.1 载体制作 根据试验目的、可能性、需要以及制作的可行性，选用橡胶片作为载体制作菌片，用橡胶手套剪制成大小为0.5×1.0 cm2，先脱脂，即用1%洗衣粉溶液煮沸30 min，再用自来水洗净。用蒸馏水再煮沸10 min，再漂洗3次。晾干。

2.3.2 染菌 把预先培养好的菌液稀释好，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。每片滴加菌液10 μL。用10 μL移液器接灭菌塑料吸头滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面，染菌105～106个以上，并使之分布均匀。滴染菌液后，染菌载体可置37 ℃温箱内干燥(约20～30 min)备用。

2.3.3 消毒 将消毒液按预先的浓度稀释好，再将菌片浸入消毒液中，放入恒温箱内，立即记时。以0.03 mol/L磷酸盐缓冲液代替消毒液，作为对照组。

2.3.4 中和与培养 定性试验：作用预定时间后，将菌片分别放入含足量中和剂的试管，中和10 min，再取出放入液体培养基内，置37 ℃培养24 h。若发生混浊即表示有细菌生长。必要时，可移植到固体培养基上，观察菌落形态，或进行涂片染色镜检，以判断生长的是否为试验菌，以排除污染。若肉汤不变混浊，应继续培养至第7天，若仍不混浊方可判为无菌生长。

定量试验：根据定性试验结果初步判定消毒剂作用时间和浓度，进行定量试验。取出菌片放于有玻璃珠的中和液内，振摇100次洗脱载体上的细菌，然后进行活菌计算及统计分析。以无菌生长管消毒液的最低浓度为最低杀菌有效浓度，以无菌生长管的最短消毒时间为该浓度杀菌最快有效时间。

杀菌率的计算：根据活菌计数的结果，计算杀菌率(Pt)。消毒t时的杀菌率(Pt)=[(n0-nt)/n0]×l00%，式中n0为消毒前或对照组活菌数。nt为消毒后或实验组活菌数。

3 结果与分析

3.1 中和剂鉴定试验 中和剂的鉴定选择大肠杆菌8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538为代表进行试验。试验中所用消毒剂的浓度为杀菌试验中使用的最高浓度，即针对大肠杆菌8099，2%柠檬酸碘溶液按1∶2500稀释，百胜-30溶液按1∶3750稀释。针对金黄色葡萄球菌ATCC6538，2%柠檬酸碘溶液按1∶5000稀释，百胜-30溶液按1∶7500稀释。

结果表明，含0.3%硫代硫酸钠、1%吐温-80的灭菌营养肉汤中和剂可以有效中和2%柠檬酸碘溶液。含0.5%硫代硫酸钠、1%吐温-80的灭菌营养肉汤中和剂可以有效中和剂百胜-30溶液。以上两种中和剂、中和产物对细菌生长无明显影响(表1)。

表1 中和剂鉴定试验结果Tab 1 The test for the identification of neutralizer

试验条件均为20±1 ℃，作用时间为5 min；以上结果为3次试验的平均值

3.2 定性试验结果 在室温条件下(20 ℃左右)，在橡胶片载体上时，对于大肠杆菌8099，2%枸橼酸碘溶液最低杀菌有效浓度为1∶320，该浓度的最短消毒时间为5 min；对于金黄色葡萄球菌ATCC6538和马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC 556，2%枸橼酸碘溶液最低杀菌有效浓度为1∶640，该浓度的最短消毒时间为5 min。对照组百胜-30溶液按1∶1920稀释时，对上述三种菌株的作用时间为1 h；当浓度提高到1∶960时，对三种菌的最短作用时间是5 min。对于蜡样杆菌芽孢，2%枸橼酸碘溶液最低杀菌有效浓度为1∶1，该浓度的最短消毒时间为10 min；对照组百胜-30溶液最低杀菌有效浓度为1∶1，该浓度的最短消毒时间为30 min。详细结果见表2～表4。

表2 2%枸橼酸碘消毒剂对三种细菌定性杀菌效果Tab 2 The qualitative germicidal effect of 2% citrate iodine solution on three kinds of bacteria

A代表大肠杆菌8009，B代表金黄色葡萄球菌ATCC6538，C代表马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC556；“+”表示有细菌生长，“-”表示无细菌生长；阳性对照均浑浊；表内结果是3次试验的平均值

表3 百胜-30消毒剂对三种细菌定性杀菌效果Tab 3 The qualitative germicidal effect of Bai Sheng-30 solution on three kinds of bacteria

此消毒剂含碘量为3%，按照最终含碘量一致的原则，稀释倍数参考受试消毒剂；A代表大肠杆菌8009，B代表金黄色葡萄球菌ATCC6538，C代表马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC556；“+”表示有细菌生长，“-”表示无细菌生长；阳性对照均浑浊；表内结果是3次试验的平均值

表4 两种消毒剂对蜡样芽胞杆菌8008定性杀菌效果Tab 4 The qualitative germicidal effect of two kinds of solutions on Bacillus cereus 8008

“+”表示有细菌生长，“-”表示无细菌生长。阳性对照均浑浊。表内结果是3次试验的平均值

3.3 定量试验结果 对四种病原菌的杀灭效果见下表5～表6。在室温条件(20 ℃左右)、橡胶片载体上时，对于大肠杆菌8099，2%枸橼酸碘溶液按1∶500稀释，5 min杀灭率均达99.90%以上，当稀释倍数再提高，即使作用时间延长，其杀菌率也不能达标；对照消毒剂百胜-30溶液按照1∶900稀释，5 min杀灭率也达99.90%以上(表5)。

如表5所示，对于金黄色葡萄球菌ATCC6538，2%枸橼酸碘溶液按1∶1000稀释，5 min杀灭率均达99.90%以上，当稀释倍数提高到1∶1200，最低作用时间是10 min，相对应的百胜-30溶液按照1∶1800稀释，最低作用10 min，杀菌率才能达标，即使提高消毒剂浓度，最低作用10 min，其杀菌率才能达99.90%以上。对于马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC 556，2%枸橼酸碘溶液按照1∶1200稀释，30 min杀灭率达99.90%以上，当浓度再提高至1∶800以上时，作用10 min杀灭率均达99.90%以上，相对应的百胜-30溶液，按照1∶1800稀释时，5 min杀灭率均达99.90%以上。

如表6所示，对于蜡样杆菌8008芽孢，枸橼酸碘溶液按1∶10稀释，1.5 h杀灭率才达99.90%以上，当药物浓度提高到1∶8以及更高浓度时，作用30 min杀灭率才能达标；对照组百胜-30溶液，按1∶10稀释时，作用1.5 h，杀灭率才达99.90%以上，当药物浓度提高1∶6稀释时，作用1 h，杀灭率才能达标。

表5 两种消毒剂对三种细菌定量杀菌试验结果Tab 5 The quantitative germicidal effect of two kinds of solutions on three kinds of bacteria

对照组菌数为106CFU/mL；枸橼酸碘溶液按1∶300、1∶400、1∶500、1∶600稀释后，分别与百胜-30溶液按1∶450、1∶600、1∶750、1∶900稀释后，最终碘含量一致。枸橼酸碘溶液按1∶600、1∶800、1∶1000、1∶1200稀释后，分别与百胜-30溶液分别按1∶900、1∶1200、1∶1500、1∶1800稀释后，最终碘含量一致；表内结果是3次试验的平均值

表6 两种消毒剂对蜡样芽胞杆菌8008芽孢定量杀菌试验结果Tab 6 The quantitative germicidal effect of two solutions against Bacillus cereus 8008

对照组菌数为106CFU/mL；枸橼酸碘溶液与百胜-30分别按1∶6、1∶8、1∶10、1∶12稀释；表内结果是3次试验的平均值

4 讨论与小结

影响消毒剂杀菌作用的因素有药物浓度、作用时间、温度等[9]。微生物附着于不同的载体，也会影响消毒和灭菌效果[10-11]。本试验初步证明了受试菌株(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、马腺疫链球菌和蜡样芽胞杆菌)附着在橡胶片载体上时，枸橼酸碘溶液和百胜-30溶液的杀菌效果。上述试验结果是建立在两种消毒剂按一定比例稀释后，最终碘含量一致的前提下(将枸橼酸碘溶液稀释为相应倍数时，消毒剂百胜-30溶液稀释倍数为上述消毒剂稀释倍数乘以1.5)得到的。对于蜡样芽胞杆菌，在定性试验中，消毒剂百胜-30稀释倍数为1∶1时，作用10 min也无作用，因此，在定量试验中，其稀释浓度相应提高，稀释倍数与受试组药物一致。

通过载体定性、定量杀菌实验得出，在橡胶片载体上时，对于大肠杆菌8099，枸橼酸碘溶液按1∶500稀释，5 min杀灭率均达99.90%以上；对于金黄色葡萄球菌ATCC6538，枸橼酸碘溶液按1∶1000稀释，5 min杀灭率均达99.90%以上；稀释倍数为1∶1200时，最低作用10 min，杀菌率才能达到99.90%；对于马腺疫链球菌兽疫亚种强毒CVCC 556，枸橼酸碘溶液按照1∶1200稀释，30 min杀灭率均达99.90%以上，当药物浓度提高至1∶800以上时，作用10 min杀菌率即可达到99.90%以上；对于蜡样杆菌8008芽孢，枸橼酸碘溶液1∶10稀释，1.5 h杀灭率才达99.90%以上，当药物浓度提高到1∶8及以上时，作用30 min杀灭率才能达标。

对照百胜-30溶液对大肠杆菌的杀灭效果要明显强于枸橼酸碘溶液；对金黄色葡萄球菌的杀灭效力与枸橼酸碘溶液相比，起作用时间略晚一些；对马腺疫链球菌兽疫亚种强毒，对照百胜-30溶液比枸橼酸碘溶液稍好；对蜡样芽孢，枸橼酸碘溶液的杀灭效果比百胜-30溶液的杀灭效果略好。建议养殖场使用消毒剂前，综合考虑本场微生物污染的情况，合理选择消毒剂。此外，应交替使用不同的消毒剂，避免因长期使用一种消毒剂导致耐药菌产生，影响消毒效果。选择复方枸橼酸碘溶液进行消毒时，应确保消毒剂使用浓度和作用时间。

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