番茄环纹斑点病毒（TZSV）侵染对辣椒防御相关物质的影响

张晓林 陈永对 穆野 赵立华 张洁 郑雪

摘要：采用高效液相色谱法（HPLC）对番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）侵染后辣椒和健康辣椒植株（CK）叶片中茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水杨酸（jalicylic acid，SA）和茉莉酸-异亮氨酸（jasmonoyl isoleucine，JA-Ile）含量进行测定。结果表明，SA含量在TZSV侵染24、48、96、120、144、168、192、216、240 h后显著高于对照组；JA含量在TZSV侵染 8、24、72、96、144、216 h后显著高于对照组；JA-Ile含量在TZSV侵染 24、48、72、96、144、216 h后显著高于对照组。 TZSV侵染可使辣椒SA、JA及其衍生物JA-Ile含量增加。

关键词：番茄环纹斑点病毒；辣椒；茉莉酸；水杨酸；茉莉酸-异亮氨酸

中图分类号：S436.418.1+2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）04-0094-04

Abstract The contents of salicylic acid （SA）， jasmonic acid （JA） and jasmonoyl-isoleucine （JA- Ile） in pepper leaves between plants infected with TZSV and healthy plants（CK） were determined by the high performance liquid chromatography （HPLC） method. The results showed that the content of SA was significantly higher than CK at 24，48，96，120，144，168，192，216 and 240 h after TZSV infection. The content of JA was significantly higher than CK at 8，24，72，96，144，216 h after TZSV infection. The content of JA-Ile was also significantly higher than CK at 24，48，72，96，144，216 h after TZSV infection. The results indicated that TZSV infection could increase the contents of SA， JA and JA-Ile in pepper.

Keywords Tomato zonate spot virus； Pepper；Jasmonic acid； Salicylic acid； Jasmonoyl-isoleucine

番茄環纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus，TZSV）属于布尼亚科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus），于2008年在云南省首次发现并报道[1]。TZSV病毒是一种RNA病毒，植物感染该病毒后，新叶上首先出现黄色同心环纹或环形带状褪绿斑点，之后由黄斑转变为枯斑，叶片出现黄化、凋零，造成整叶或半叶呈红褐色坏死。感病植株还会出现矮化、顶芽萎蔫下垂、叶片皱缩退绿等症状。TZSV寄主植物广泛，包含茄科、菊科、蓼科、藜科、豆科、葱科、鸢尾科共7 科的25 种植物，对云南省番茄、辣椒、烟草、花卉等经济作物的生产构成严重威胁[2，3]。

病毒侵染可造成植物防御次生物质含量、解毒和防御相关酶活性的改变，并对植物感知昆虫危害启动相应的防御反应产生干扰。研究表明茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水杨酸（salicylic acid，SA）作为植物激素是目前已知的参与高等植物防御反应的一类重要的信号物质[4]。SA在植物对病原菌的过敏反应和系统获得抗性中起主要作用[5]。在虫害诱导的直接和间接防御反应中，JA是植物诱导伤害反应的一种重要信号分子，其衍生物茉莉酸-异亮氨酸（jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile）是JA生成的关键底物之一，主要诱导植物产生各种抗性[6，7]。研究表明烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）对烟草的侵染可能抑制了植物对昆虫取食的防御反应，这种抑制作用很可能是由病毒侵染导致寄主植物内源SA含量的上升对JA途经的抑制引起的[8]。中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）侵染烟草，可抑制植物JA防御途径，提高B型烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）对寄主植物的适应性[9]。

本试验以TZSV-辣椒互作为切入点，研究辣椒感染TZSV前后SA、JA、JA-Ile等相关防御物质含量的变化，为下一步解析TZSV侵染诱导的寄主植物防御相关机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试辣椒品种为Zunla-1号，由遵义市农业科学研究院提供。人工气候室中栽培，栽培条件：温度25℃，湿度60%，光照时间16 h/d。

供试TZSV毒源来源于云南元谋的番茄叶片。

1.2 试验方法

TZSV侵染辣椒植株的人工接种方法：将含有TZSV毒源的番茄叶片加入接种缓冲液研磨直至汁液溢出，用棉签蘸取少量汁液，在洒了少许金刚砂的辣椒（苗龄为35 d）叶面上摩擦2～3次，10 min后用清水冲洗辣椒叶片。

试验设TZSV侵染辣椒植株和健康辣椒植株两个处理组，以后者为对照。自TZSV侵染时开始计算，分别于8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h后选取TZSV侵染株和健康株相同部位的叶片0.15 g，重复取样5次混匀备用。

1.3 测定指标与方法

水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、茉莉酸-异亮氨酸（JA-Ile）检测方法参见文献[10，11]的方法并根据本实验室情况稍作改进：将采集的叶片在液氮中研磨，称取0.15 g于2.5 mL离心管，加入1 mL乙酸乙酯，后根据不同的测定指标分别加入200 ng 13C2-JA（水杨酸的内标物质）或D4-SA（茉莉酸的内标物质）或香豆酸（茉莉酸-异亮氨酸的内标物质），将每个样本在Fest Prep均质器上均质化，4℃最大速度离心10 min后将上清转移到新的2 mL离心管中，再将沉淀物用0.5 mL乙酸乙酯进行提取，离心分离，合并两次上清液在真空浓缩器（Eppendorf）上干燥，后置于0.5 mL 70%甲醇（V/V）中并离心澄清。将上清液移到玻璃小瓶中，然后通过HPLC-MS / MS分析。

1.4 数据处理与分析

数据均采用SPSS 11.5软件进行分析，使用Duncans新复极差法比较处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 TZSV侵染辣椒植株中SA含量的变化

TZSV侵染株8 h后SA含量变化较为平稳，96 h后开始下降，至168 h达到最低，为16.01 ng/gFW，216 h达到最大值205.14 ng/gFW，后迅速降低，240 h下降为41.50 ng/gFW。TZSV侵染组SA含量仅在侵染168 h后低于对照组，其余时间均高于对照组，且在侵染24、48、96、120、144、168、192、216、240 h时达显著水平（表1）。

2.2 TZSV侵染辣椒植株中JA含量的变化

TZSV侵染株8 h时JA含量最高，为269.22 ng/gFW，之后逐渐下降，48 h后开始缓慢上升至72 h后开始回落，144 h后下降，至240 h后达到最低值，6.80 ng/gFW。TZSV侵染组JA含量在侵染后120、168、192 h低于对照组，但差异不显著，在侵染后8、24、72、96、144、216 h則显著高于对照组（表1）。

2.3 TZSV侵染辣椒植株中JA-Ile含量的变化

TZSV侵染株8 h后 JA-Ile含量迅速上升，并于24 h后达到最大值185.18 ng/gFW。在侵染48～96 h范围内变化较为平缓，而96 h后急剧下降，120 h后又急剧上升，144 h后开始回落。在168～240 h范围内变化较为平稳，其中240 h后JA-Ile达最低值4.21 ng/gFW。TZSV侵染组JA-Ile含量仅在侵染后192 h低于对照组，但差异不显著，其它时间均高于对照组，且在侵染24、48、72、96、144、216 h时达到显著水平（表1）。

3 讨论与结论

在植物对病虫害的诱导防御反应中，SA和JA被认为是最重要的信号分子，在植物防御病原菌入侵过程中扮演着重要的角色[10，11]。SA是植物体内含量较低的一种内源酚类物质，参与多种生理过程，是诱发植物系统获得抗性（systemic acquired resistance， SAR）产生的关键信号分子之一[10]。JA及其衍生物JA-Ile，是植物受昆虫取食、机械伤害等诱导的内源信号分子，可启动植物体内抗病防御基因的表达，从而调控植物的防御反应，同时JA在调节植物生长发育、光合特性、抗逆反应等方面起着重要作用，参与病原菌及其昆虫的诱导抗病并激发植物的诱导系统抗性（induced systemic resistance， ISR）[11]。

植物受到病原菌侵染后会大量积累并诱导JA、SA含量上升及防卫基因的表达。研究表明接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的烟草及接种烟草坏死病毒（Tobacco necrosis virus，TNV）的黄瓜，其SA含量显著高于未接种病毒的健康植株[12，13]。以拟南芥、番茄等为材料的试验得到相同的结果[14]。本研究也发现类似的现象，在TZSV侵染辣椒叶片后，除168 h外，其余时间TZSV侵染组SA含量均高于对照组，且在216 h时达到最大，而对照组SA含量变化波动不大。JA-Ile是JA的关键底物之一，可能与JA的瞬时诱导合成以及移动进而抵御损伤胁迫有关。大豆、番茄、烟草、拟南芥在遭受损伤后，体内JA、JA-Ile含量均显著升高[15-17]；小麦感染白粉病后，JA含量也显著高于健康植株[18]。本研究发现TZSV侵染组叶片中JA含量在120、168、192 h后虽稍低于对照组，但差异不显著，其余时间下均高于对照组； JA-Ile含量仅在接种192 h时，TZSV侵染组稍低于对照组。本研究结果表明，TZSV侵染诱导了辣椒叶片中SA、JA、JA-Ile含量的上升，辣椒植株启动了抗TZSV相关的防御机制。

由水杨酸和茉莉酸介导的植物防御机制非常复杂，二者之间相互拮抗、又存在协同反应，许多生物和非生物诱导因子都能激发水杨酸和茉莉酸的合成，激活防卫反应基因表达。在以后的研究中，应深入探讨水杨酸和茉莉酸途径在调控寄主植物应对TZSV 侵染防御反应中的相互作用，明确水杨酸和茉莉酸抗病信号传递过程中的调控因子及关键基因，进一步揭示TZSV侵染诱导的寄主植物防御相关机制。

参 考 文 献：

[1] Dong J H， Cheng X F， Yin Y Y， et al. Characterization of tomato zonate spot virus， a new tospovirus in China[J]. Archives of Virology， 2008， 153 （5）： 855-864.

[2] Dong J H， Zhang Z K， Yin Y Y， et al. Natural host ranges of tomato zonate spot virus in Yunnan[J]. Journal of Insect Science，2010， 10： 12-13.

[3] 郑雪，刘春明，李宏光，等. 云南省红河地区传播番茄斑萎病毒属病毒的蓟马及其寄主植物种类调查[J]. 中国植保导刊，2013， 33（3）： 41-44.

[4] Pieterse C M J， Dicke M. Plant interactions with microbes and insects： from molecular mechanisms to ecology[J]. Trends in Plant Science， 2007， 12（12）：564-569.

[5] Maleck K， Dietrich R A. Defense on multiple fronts： how do plants cope with diverse enemies？[J]. Trends Plant Science， 1999， 4（6）： 215-219.

[6] Schmelz E A， Alborn H T， Engelberth J， et al. Nitrogen deficiency increases volicitin-induced volatile emission， jasmonic acid accumulation， and ethylene sensitivity in maize[J]. Plant Physiology， 2003， 133： 295-306.

[7] 桂連友， 刘树生， 陈宗懋. 外源茉莉酸和茉莉酸甲酯诱导植物抗虫作用及其机理[J]. 昆虫学报， 2004， 47（4）：507-514.

[8] Preston C A， Lewandowski C， Enyedi A J， et al. Tobacco mosaic virus inoculation inhibits wound-induced jasmonic acid-mediated responses within but not between plants[J]. Planta， 1999， 209（1）： 87-95.

[9] Zhang T， Luan J B， Qi J F， et al. Begomovirus-whitefly mutualism is achieved through repression of plant defences by a virus pathogenicity factor[J]. Molecular Ecology， 2012， 21（5）： 1294-1304.

[10]钟冬莲， 任传义， 李祖光，等. HPLC-MS/MS法同时测定马尾松松针中水杨酸和茉莉酸[J]. 分析试验室， 2017（2）：164-167.

[11]Seraglioa S K T， Valese A C， Daguer H， et al. Development and validation of a LC-ESI-MS/MS method for the determination of phenolic compounds in honeydew honeys with the diluted-and-shoot approach[J]. Food Research International， 2016， 87： 60-67.

[12]Kazan K， Manners J M. Jasmonate signaling： toward an integrated view[J].Plant Physiology， 2008， 146： 1459-1468.

[13]Loake G， Grant M. Salicylic acid in plant defence the players and protagonists[J].Current Opinion in Plant Biology， 2007， 10：466-472.

[14]MalamyJ， Carr J P， Klessig D F， et a1.Salicylic acid： a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection[J]. Science，1990，250：1002-1004.

[15]Métraux J P， Signer H， Ryals J， et al. Increase in salicylic acid at the onset of systemic acquired resistance in cucumber [J]. Science， 1990，250（4983）：1004-1006.

[16]Uknes S， Winter A M， Delaney T， et al. Biological induction of systemic acquired resistance in Arabidopsis[J].Molecular Plant-Microbe Interactions，1993，6：692-698.

[17]Creelman R A， Tierney M L， Mullet J E. Jasmonic acid/methyl jasmonate accumulate in wounded soybean hypocotyls and modulate wound gene expression[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1992， 89（11）：4938-4941.

[18]ODonnell P J， Calvert C， Atzorn R， et al. Ethylene as a signal mediating the wound response of tomato plants[J].Science，1996， 274（5294）： 1914-1917.

[19]Chizuru S， Yoshiya S， Kensuke N， et al. Kinetics of the accumulation of jasmonic acid and its derivatives in systemic leaves of tobacco （Nicotianatabacumcv. Xanthinc） and translocation of deuterium-labeled jasmonic acid from the wounding site to the systemic site[J].Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry，2009， 73（9）： 1962-1970.

[20]马文斌. 茉莉酸与小麦抗白粉病关系研究[D].郑州：河南农业大学，2012.