生防解淀粉芽孢杆菌Bs—18 TnYLB—1突变体文库的构建

孙淑琴 孙冰冰 杨秀荣 张惟 霍建飞

摘要：解淀粉芽孢杆菌Bs-18是一株对黄瓜白粉病具有显著防效的生防菌株，為深入研究此菌株的生防作用机理，本研究应用电击法构建了携带转座子TnYLB-1的穿梭质粒pMarA转化Bs-18的突变体文库。通过对转座温度和转座时间的筛选，筛选出50℃高温诱导16 h可获得最大转座成功率，并对突变体进行了PCR验证。Bs-18突变体文库的构建为研究其生防功能基因并深入揭示其生防作用机制奠定了基础。

关键词：突变体文库；转座子；生防功能基因

中图分类号：S476.1+Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）04-0012-04

Abstract Bacillus amyloliquefaciens Bs-18 is a biocontrol strains against cucumber powdery mildew with significant control effect. In this paper， the mutant library of Bs-18 was constructed with the shuttle plasmid pMarA carrying transposon TnYLB-1 by the electric shock method to deeply study the molecular mechanism of the biocontrol strain. Through screening transpositional temperature and time， the maximum transpositional success rate was obtained after induced at 50℃ for 16 hours. The mutants were verified by PCR. The construction of Bs-18 mutant library laid a foundation for further study on its biocontrol function genes and mechanism.

Keywords Mutant library； Transposon； Biocontrol function genes

随着许多微生物基因组全序列的获得，人们对微生物关注和研究的热点逐渐从结构基因组学转移到功能基因组学上。转座子随机突变技术因操作简单逐渐成为研究功能基因组（如发现新基因、克隆功能基因、发掘已知基因的新功能）的一种有效工具。目前利用转座子随机突变技术对于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的研究较为深入，并且获得了与芽孢形成、生物被膜形成以及植物与微生物互作等相关基因[1，2]。随着对转座子技术研究的深入，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）在这一领域的工作也逐渐展开。郝建安等[3]通过对解淀粉芽孢杆菌Mu转座突变子进行表型筛选，并结合克隆和测序发现了2个新的抑菌作用调节基因rpmGA和yxlC。高卫华等[4]对1株野生型解淀粉芽孢杆菌进行了mini-Tn10 转座突变库的构建，根据菌落形态差异进行初筛，利用结晶紫染色法筛选生物被膜缺陷菌株，由此发现了芽孢杆菌生物被膜形成相关基因。从突变库中筛选到4株生物被膜缺陷株，经过鉴定发现突变株citB、citG、gpsA和yvfB基因发生插入突变，其中citB、citG 和gpsA均与能量代谢相关，yvfB基因功能未知。由此可见，转座突变技术已成为发现功能基因的一种有效手段。穿梭质粒载体 pMarA 上携带转座子 TnYLB-1，它具有转座频率高、插入稳定、随机插入、非寄主专化性等优点，已成为人们研究细菌基因功能的首选转座子。

Bs-18是本实验室分离自黄瓜根系的微生物，大田防治试验表明其对黄瓜白粉病的防效达79%，经生理生化和分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）。本研究以携带转座子TnYLB-1的质粒pMarA为插入质粒，通过电击法转化野生生防菌株Bs-18，筛选高温诱导转座的最佳温度和时间，从而构建Bs-18的转座插入突变体文库，为研究其生防功能基因及深刻揭示生防解淀粉芽孢杆菌的生防作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 菌株Bs-18（B. amyloliquefaciens Bs-18）由本实验室分离保存。质粒pMarA购自BGSC中心。

1.1.2 引物 本试验引物合成和序列测定均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

1.1.3 试剂 DL2000、MIX等分子试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；卡那霉素（Kan）、红霉素（Erm）购自上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏等其它试剂均为国产分析纯。

1.2 质粒转化生防解淀粉芽孢杆菌Bs-18

1.2.1 质粒pMarA转化Bs-18菌株 挑取单菌落Bs-18接种于5 mL试管中，37℃、160 r/min摇床过夜培养。将培养液按1%接种量接种于20 mL LB液体培养基中，摇床培养至OD600为0.65左右。将培养好的菌液冰浴20 min。4℃、8 000 r/min离心2 min，收集菌体。加入10 mL预冷的 ddH2O清洗菌体细胞3次。再加入ddH2O重悬菌体，制得感受态细胞。在100 μL感受态细胞中加入1 μL质粒pMarA，均匀混合，将混合物移至预冷的电击杯中，以1.1 kV电压，电穿孔仪BIO-RAD进行脉冲电击（电阻200 Ω，电容25 μF），电击后迅速加入400 μL复苏培养基，37℃温浴60 min，涂布含Kan（50 μg/mL）和Erm（10 μg/mL）的双抗平板，37℃培养过夜，第二天挑取平板上的转化子Bs18-MA[5-7]。

1.2.2 转化子的验证 从转化平板上挑选转化子，接种于含Kan（50 μg/mL）的LB液体培养基中，使用离心柱型质粒小提试剂盒提取转化子质粒。

使用引物oAtnpFwd、oAtnpRev扩增转化子中的HimarⅠ转座酶编码基因片段。

使用引物Km-F和Km-R扩增转化子中的卡那霉素抗性基因片段。

以上验证均以质粒pMarA作为阳性对照，以Wt作为阴性对照，扩增程序为：96℃ 2 min；94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 2 min，30 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever[8]。

1.3 高温诱导转座子TnYLB-1转座

1.3.1 转座子TnYLB-1转座条件的优化 挑取转化子于LB（Kan 50 μg/mL，Erm 10 μg/mL）液体培养基中，37℃、160 r/min振荡培养24 h。将菌液系列稀释至10-3～10-6，取100 μL涂布LB （Kan 50 μg/mL）平板，将平板置于不同温度条件下（分别设45、46、47、48、49、50℃温度梯度），分别处理不同时间（4、10、16、22 h）。用无菌牙签挑取LB平板上的同一单菌落分别点种于Erm和Kan抗性平板上，进行原位生长比较试验。具有Kan抗性而缺失Erm抗性的菌株即为TnYLB-1转座插入Bs-18菌株基因组的突变子，挑取突变子构建菌株Bs-18的突变体文库[9]。

转座成功率（%）=（K-E）/K×100

式中K∶代表卡那霉素平板上的菌落数，E∶代表红霉素平板上的菌落数。

1.3.2 突变体的验证 从Bs-18的突变体文库中随机挑取12个突变体，提取基因组DNA，用引物oITR 扩增突变体基因组的TnYLB-1转座子片段，验证TnYLB-1转座子片段是否成功插入到Bs-18的基因组中。以质粒pMarA作为阳性对照，以Wt作为阴性对照，扩增程序为：96℃ 2 min；94℃ 45 s，66℃ 1 min，72℃ 2 min，30 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever。

2 结果与分析

2.1 Bs-18的转化

将携带TnYLB-1转座子的穿梭质粒pMarA转化入解淀粉芽孢杆菌Bs-18的感受态细胞中，获得数个转化子Bs18-MA。使用离心柱型质粒小提试剂盒提取转化子質粒。通过引物oAtnpFwd-oAtnpRev扩增质粒中的HimarⅠ转座酶编码基因（如图1A），待验证转化子4—6均得到约为1.5 kb的片段，与质粒pMarA得到的片段一致，而Wt没有扩增出条带。又通过引物Km-F、Km-R扩增质粒中的卡那霉素抗性基因（如图1B），

待验证转化子2—4得到了与质粒pMarA一致的片段，而Wt没有扩增出此条带。以上验证结果表明，质粒pMarA已经成功转入到菌株Bs-18中，转化子Bs18-MA可以用于后续试验。

2.2 高温诱导转座子TnYLB-1的转座

由于质粒pMarA含有温度敏感型复制子repG+ts，30℃时在菌体中能复制，而50℃不能复制，在50℃下，质粒上的HimarⅠ在启动子PA作用下表达，并识别转座子TnYLB-1两端的反向重复序列ITR，使转座子从质粒上跳跃到宿主菌基因组上，并识别基因组上的插入位点“TA”，随机插入宿主基因组。在转座子发生转座后，其余的质粒骨架（含ErmR）将在细胞中被降解，因此在LBKan平板上生长而在LBErm平板上不生长的菌落即为成功发生转座的突变子。原位生长比较试验中随机挑选2 000株目标突变子，构建菌株Bs-18的TnYLB-1突变体文库。

通过菌液浓度系列稀释表明稀释浓度为10-5时，菌落在LB平板中能够较好的以单菌落形式生长，后续试验均采用10-5浓度涂板。通过比较不同转座温度及转座处理时间对转座成功率的影响发现，如图2所示，在同一温度诱导下，随诱导时间的延长而逐渐升高，16 h处理的转座成功率最高，之后转座成功率又呈现降低的趋势；同一诱导时间不同诱导温度下，50℃处理诱导转座成功率最高，其次为49℃。表明转座子TnYLB-1在50℃高温诱导处理16 h后能最大效率地（高达70%）转座菌株Bs-18。

2.3 突变体的验证

扩增结果显示，12个随机挑选的突变体基因组中都能扩增出与质粒pMarA中的TnYLB-1转座子片段大小相同的片段，与阳性对照质粒pMarA的扩增结果一致，而野生型菌株Bs-18不能扩增出该片段（图3），说明TnYLB-1已成功插入到Bs-18基因组中。

3 讨论与结论

转座子（transposon，Tn）又称转座因子或跳跃因子，是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的DNA片段，于20世纪50年代初由McClintock在玉米基因组中首次发现。当转座子在基因组间或组内跳跃而插入到某个基因时，就可能引起插入处基因发生突变或使邻近插入处基因的表达活性发生改变。本研究利用穿梭质粒pMarA上的转座子TnYLB-1转化B. amyloliquefaciens Bs-18，构建了含2 000株菌株的突变体文库，为更好地揭示生防菌株Bs-18的生防功能基因奠定了基础。

本研究利用电击法将质粒pMarA转化Bs-18菌株的转化效率很低，分析原因一可能是由于质粒pMarA过大，增加了转化的难度；二可能是由于B. amyloliquefaciens Bs-18的感受态细胞制备困难，今后还应在芽孢杆菌的感受态细胞制备方面做更深一步的研究，为提高转化效率奠定基础。本试验转化成功的转化子Bs18-MA成为后续试验转座子TnYLB-1随机插入Bs-18基因组的重要前提和基础。

本试验通过诱导条件筛选，表明转座子TnYLB-1随机插入解淀粉芽孢杆菌Bs-18基因组的最佳温度是50℃，最佳诱导时间为16 h。有研究表明，转座子TnYLB-1的转座效率在10-2数量级，而在本研究中，没有采用转座效率，而是采用转座成功率。因为经高温诱导转座后在LBKan上生长的菌落并不一定是转座成功的突变体，必须进行原位生长比较试验才能最终得到正确的突变体，即经高温诱导后，在含Kan抗性平板上生长而在含Erm的抗性平板上不能生长的菌落数占在含Kan抗性平板上生长的菌落数的百分比。转座成功率的表示方法简单，省去了换算过程，能更直观地表明转座成功与否。诱导条件的筛选为快速建立突变体库节省了大量的时间和精力，也为后续突变体的筛选提供了大量的试验材料。

参 考 文 献：

[1] Budiharjo A，Chowdhury S P， Dietel K， et al. Transposon mutagenesis of the plant-associated Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum FZB42 revealed that the nfrA and RBAM17410 genes are involved in plant-microbe-interactions[J]. PLoS One，2014，9（5）：e98267.

[2] Le Breton Y， Mohapatra N P， Haldenwang W G. In vivo random mutagenesis of Bacillus subtilis by use of TnYLB-1， a mariner-based transposon[J]. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（1）：327-333.

[3] 郝建安，曹志輝，徐海津，等.利用人工Mu转座技术研究解淀粉芽孢杆菌的功能基因[J].生物技术通讯，2006，17（3）：311-313.

[4] 高卫华，郝建安，夏思源，等.利用mini-Tn10转座系统研究芽孢杆菌生物被膜形成相关基因[J].微生物学报，2009，36（3）：345-349.

[5] 范海燕，汝津江，高坦坦，等.枯草芽胞杆菌9407TnYLB-1转座子突变体库的构建[J].中国科技论文，2016，11（18）：2082-2086.

[6] 陈永轩，王娜娜，高小宁，等.用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌EDR4突变体库[J].西北农业学报，2014，23（11）：123-129.

[7] 李信志，卢争辉，周玉玲，等.枯草芽孢杆菌SCK6超级感受态的制备和转化条件的优化[J].生物工程学报，2017，33（4）：692-698.

[8] 马欣，刘俊，乔俊卿，等.利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突变体文库[J].南京农业大学学报，2011，34（6）：77-81.

[9] 彭玲.植物内生生防蜡样芽孢杆菌0-9菌株转座子插入突变体库的建立及评价[D].开封：河南大学，2011.