益气活血方对大鼠心肌梗死边缘区Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA表达的影响

，，，，，，， ，，，， ，

心力衰竭是各种心血管系统疾病发展的终末阶段，其临床表现复杂，预后不良，死亡率极高，严重危害着人类的生命健康。心力衰竭的病理机制较为复杂，其中心环节是心脏结构和功能的失代偿。临床和基础研究均表明，心力衰竭的发生与心肌细胞内各种亚细胞器损伤及其联系失衡(也称为亚细胞器重构)导致细胞损伤、心脏结构和功能的失代偿密切相关[1-3]。同时，心肌能量代谢紊乱亦是心力衰竭时心室重构和心功能异常的重要机制之一。既往研究证明，益气活血方药除了能扩张冠脉、抑制血小板聚集、清除氧自由基等改善血流动力学机制外，能增加肌浆网Ca2+-ATP酶活性，改善心肌能量代谢[4]，减轻心室重构和改善心功能，发挥心肌保护作用[5]。近年来研究发现，Sigma-1受体(Sigma-1 receptor，Sigma-1R)作为内质网/线粒体信号调制器，通过改善亚细胞器间Ca2+信号转导，与三磷酸肌醇受体[inositol(1，4，5)-triphosphate receptor，IP3R]相互作用，间接影响Ca2+-ATP酶(SERCA2a)活性，促进心肌细胞存活，最终通过抑制心室重构和改善心肌能量代谢缓解心力衰竭[6-7]。本研究制备心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，通过观察益气活血方对该模型心肌梗死边缘区Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA表达的影响，进一步探讨其保护心肌细胞的作用及可能机制，为临床治疗心力衰竭明确新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年健康雄性SD大鼠25只，6周龄，SPF级，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：scxk(京)2012-0001。实验期间饲养于北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室SPF级实验动物房。

1.2 实验仪器 ALC-V8 动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)；心电图机(厦门锡尔摩电气有限公司，FX-7402 Cardimax)；Vevo高分辨率小动物超声影像系统(加拿大Visual Sonics公司，TM2100型)；千分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司，JA1003N型)；4 ℃离心机(上海沪粤明科学仪器有限公司，TGL-16G)；Gene Quant紫外分光光度计(Pharmacia Biotech公司)；基因扩增仪GeneAmp PCR system 9700(美国AB公司，Applied Biosystems)；安捷伦实时荧光定量PCR仪Mx3000P(美国安捷伦科技公司)。

1.3 试剂 Trizol试剂(批号：15596026，美国Ambion公司)；反转录试剂盒(批号：K1622，美国ThermoFisher Scientific公司)；SYBR Green PCR Master Mix(美国ABI公司)。所用引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。

1.4 心肌梗死大鼠模型制备 采用大鼠左冠状动脉前降支结扎法制备大鼠急性心肌梗死模型[8]。大鼠经1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉后仰卧位固定，经喉行气管插管术，连接呼吸机，以80次/min、潮气量(0.7～0.8) mL行人工呼吸。左胸前区去毛备皮，络合碘消毒，在左侧第三、四肋处横向切开皮肤，长1.5 cm，钝性分离肌层，沿第三、四肋间隙打开胸腔，以开胸器扩大手术视野，撕开心包，在动脉圆锥与左心耳之间下2 mm处用5/0线结扎左冠状动脉前降支(假手术组只穿线，不结扎)，复位心脏，逐层缝合，心电图示ST段抬高为造模成功。术后连续3 d注射青霉素预防感染，常规饲养。

1.5 动物分组及给药 造模大鼠术后随机分为模型组、益气活血低剂量组(益低组)、益气活血高剂量组(益高组)和氟伏沙明(Sigma-1R激动剂)组。益低组和益高组分别予以含生药量15 g/kg、30 g/kg的益气活血方药物，氟伏沙明组予以氟伏沙明(1 mg/kg)灌胃；模型组和假手术组大鼠给予与治疗组同等容积的蒸馏水灌胃，每日1次，于造模后24 h开始，连续8周(每组大鼠10只)。益气活血方组方：黄芪40 g，党参40 g，丹参20 g，川芎20 g，赤芍20 g，红花20 g。由北京中医药大学东直门医院药房提供。由本实验室水煎浓缩制备，分装4 ℃保存。氟伏沙明为进口药品，注册证号 H20140519 ，荷兰Abbott Healthcare Products B.V公司生产。

1.6 大鼠超声心动图检测 大鼠连续给药8周后，1%戊巴比妥钠50 mg/kg体重腹腔麻醉，仰卧位固定于鼠板，胸部备皮，应用超声诊断仪和高频线阵探头检测心脏结构和功能。心脏检测，取胸骨旁左室长轴切面，由二维超声引导M型曲线进行测量。

1.7 心脏质量指数测量 术后8周，称量体重，麻醉，开胸取心脏，剪去非心组织，蘸干水分，用精密天平称量心脏质量，计算心脏质量/体质量(mg/g)，即为心脏质量指数。

1.8 心肌组织Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA的检测 取大鼠心肌梗死边缘区组织冰上匀浆，Trizol法提取心肌组织总RNA。测定吸光度A260，A280，计算RNA浓度及纯度。取2 μg总RNA，根据说明书配制 20 μL 反应体系，在42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min条件下进行反转录，得到 cDNA 链。以 cDNA 为模板采用real-time PCR法检测心肌组织Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA的相对表达量。扩增条件为：95 ℃10 min预变性，95 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40次循环。Sigma-1R、SRECA2a、IP3R mRNA的相对表达量按照2-△△ct法计算。引物序列详见表1。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 超声心动图结果 在冠状动脉结扎术后8周，大鼠的心脏结构发生了重构，与假手术组相比，模型组大鼠左室舒张末内径(LVDd)、左室收缩末内径(LVDs)、左室舒张末期容积(LV VoLd)、左室收缩末期容积(LV VoLs)显著增加(P<0.01)，左室后壁舒张末厚度(LVPWTd)、左室后壁收缩末厚度(LVPWTs)显著降低，而各药物组大鼠上述心肌重构指标较模型组有不同程度减轻(P<0.01)。同时，超声心动图结果发现，与假手术组比较，模型组大鼠的心脏射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)显著降低(P<0.01)，而各药物组可以显著改善心肌梗死大鼠心脏EF、FS(P<0.01)。详见表2、表3。

表2 大鼠冠状动脉结扎后益气活血方干预 8 周超声心动图检测的形态学指标比较(±s)

表3 大鼠冠状动脉结扎后益气活血方干预 8 周超声心动图检测的功能学指标比较(±s) %

2.2 心脏质量指数 与假手术组比较，模型组大鼠心脏质量指数显著增加(P<0.01)。与模型组比较，益气活血低剂量组、益气活血高剂量组和氟伏沙明组大鼠的心脏质量指数均显著降低(P<0.01)。详见表4。

表4 各组大鼠心脏质量指数比较(±s) mg/g

2.3 心肌组织Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA表达 每组取5只检测，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Sigma-1R、SERCA2a的表达降低(P<0.05)，IP3R mRNA表达明显增加(P<0.01)。与模型组比较，各药物组的Sigma-1R表达均显著上调(P<0.01)；益低组SERCA2a无统计学意义，益高组SERCA2a表达明显增加(P<0.01)，氟伏沙明组SERCA2a表达增加(P<0.05)；益低组、益高组IP3R mRNA与模型组比较表达降低(P<0.05)，氟伏沙明组IP3R mRNA表达显著降低(P<0.01)。详见表5。

表5 各组 Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA水平比较 (2-△△Ct,±s)

3 讨 论

本实验采用左冠状动脉前降支结扎法制备大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，模拟临床上较为常见的缺血性心脏病如冠心病心肌梗死所致的心力衰竭，是现今成熟且公认的心力衰竭动物模型[8]。同时针对该模型气虚血瘀的病机关键，构建临床经验方益气活血方，方中黄芪、党参益气生血，丹参、川芎、赤芍、红花活血祛瘀，全方具有扶正祛邪、标本兼顾的特点。研究表明，通过超声心动图、心脏质量指数检测，以Sigma-1R激动剂氟伏沙明作为阳性对照药物，结果显示益气活血方低剂量组、高剂量组不同程度地对心肌梗死后心力衰竭模型大鼠左室重构及心功能有改善作用，其机制与调节Sigma-1R及其相关信号分子表达有关。

越来越多的研究表明，Sigma-1R作为细胞内信号调制器，结合不同的配体，调控心血管系统的功能[6- 9]，包括调控细胞器之间信号转导、Ca2+转运、细胞能量代谢以及缓解内质网应激损伤，促进细胞存活[6]，在改善心肌细胞缺血缺氧，减轻心室重构，改善心功能等方面发挥着重要作用。Sigma-1R是内质网重要的伴侣蛋白，研究表明Sigma-1R在大鼠心脏[10]、肾脏[11]和胸主动脉[12]高表达。在细胞中Sigma-1R通常驻留在内质网与线粒体相接触称为线粒体相关内质网膜(mitochondrion associated ER membrane，MAM)区域。在此区域Sigma-1R通过调节线粒体/内质网之间信号通路，影响线粒体内钙稳态和细胞的能量代谢，决定细胞存活[7]。

已有研究发现，正常生理条件下，位于MAM区的Sigma-1R与葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)在内质网膜形成Ca2+敏感复合物。在Sigma-1R激动剂的刺激下，Sigma-1R与GRP78解离，与内质网膜上构象不稳定的IP3R相互作用，增强从内质网向线粒体转运的Ca2+信号[13- 14]，通过恢复线粒体大小[15]及三羧酸循环增加产能，增加ATP。并进一步增加内质网SERCA2a酶活性，使肌浆网的Ca2+升高，最终通过改善心肌细胞Ca2+循环障碍和能量代谢缓解心力衰竭[7]。为证实Sigma-1R在该过程中起主要调节作用，有研究者应用Sigma-1R拮抗剂刺激，观察到Sigma-1R抑制剂不可逆地结合Sigma-1R，抑制其表达并削弱Sigma-1R与IP3R形成复合体，抑制Ca2+进入线粒体，并诱导内质网内Ca2+释放到胞质，从而导致线粒体ATP减少，导致不良心肌的重构和心功能恶化[16-19]。许多Sigma-1R激动剂和拮抗剂的一系列实验表明，Sigma-1R调控的内质网/线粒体间Ca2+转运，影响SERCA2a酶活性，改善亚细胞器损伤和心肌能量代谢，减轻心力衰竭时心室重构和心功能恶化。

临床实践表明，益气活血方药治疗心血管疾病作用显著，但其作用机制尚未完全阐明。本实验通过检测益气活血方对心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌梗死边缘区Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA表达的影响，以期发现其作用的分子机制，指导临床实践。

本研究表明益气活血方可能是通过上调Sigma-1R、SERCA2a mRNA的表达，抑制IP3R mRNA表达，调控内质网及线粒体间Ca2+信号转导起到保护心肌细胞的作用。但亚细胞器间信号转导是一个复杂的网络结构，对于Sigma-1R在保护心肌细胞及益气活血方对其影响更为深入的分子机制，仍需进一步研究，从而为心血管疾病的治疗明确新靶点。

参考文献：

[1] Dhalla NS,Dent MR,Tappia PS,et al.Subcellular remodeling as a viable target for the treatment of congestive heart failure[J].J Cardiovasc Pharmacol Ther,2006,11(1):31-45.

[2] Babick AP,Dhalla NS.Role of subcellular remodeling in cardiac dysfunction due to congestive heart failure[J].Med Princ Pract,2007,16(2):81-89.

[3] 吴朝进,赵新军.益气活血方治疗慢性心力衰竭的临床研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2015,13(18):2041-2044.

[4] 陈金星,赵明镜,张壮.活血益气药不同剂量配伍对心梗后心衰大鼠心脏系数及功能的影响[J].中国中药杂志,2003,28(5):66-69.

[5] 陈金星,秦英,吕唏莹,等.心梗后心力衰竭大鼠心脏基因表达谱及益气活方对其血流动力学影响的研究[J].北京中医药大学学报,2003,26(5):31-34.

[6] Hayashi T,Su TP.Sigma-1 receptor chaperones at the ER-mitochondrion interface regulate Ca(2+) signaling and cell survival[J].Cell,2007,131(3):596-610.

[7] Su TP,Hayashi T,Maurice T,et al.The sigma-1 receptor chaperone as an inter-organelle signaling modulator[J].Trends Pharmacol Sci,2010,31(12):557-566.

[8] 刘振,刘玲玲,杨廷桐.两种大鼠心肌梗死模型的比较研究[J].动物医学进展,2010,31(4):19-25.

[9] Tagashira H,Bhuiyan S,Shioda N,et al.Sigma 1-receptor stimulation with fluvoxamine ameliorates transverse aortic constriction-induced myocardial hypertrophy and dysfunction in mice[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,299(5):H1535-H1545.

[10] Bhuiyan MS,Fukunaga K.Stimulation of sigma-1 receptor signaling by dehydroepiandrosterone ameliorates pressure overload-induced hypertrophy and dysfunctions in ovariectomized rats[J].Expert Opin Ther Targets,2009,13(11):1253-1265.

[11] Bhuiyan S,Fukunaga K.Stimulation of Sigma-1 receptor by dehydroepiandrosterone ameliorates hypertension-induced kidney hypertrophy in ovariectomized rats[J].Exp Biol Med (Maywood),2010,235(3):356-364.

[12] Bhuiyan MS,Tagashira H,Fukunaga K.Dehydroepiandrosterone-mediated stimulation of sigma-1 receptor activates Akt-eNOS signaling in the thoracic aorta of ovariectomized rats with abdominal aortic banding[J].Cardiovasc Ther,2011,29(4):219-230.

[13] Hayashi T,Su TP.Regulating ankyrin dynamics:Roles of sigma-1 receptors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(2):491-496.

[14] Monnet FP,Morin-Surun MP,Leger J,et al.Protein kinase C-dependent potentiation of intracellular calcium influx by sigma1 receptor agonists in rat hippocampal neurons[J].J Pharmacol Exp Ther,2003,307(2):705-712.

[15] Hirano K,Tagashira H,Fukunaga K.Cardioprotective effect of the selective sigma-1 receptor agonist,SA4503[J].The Pharmaceutial Society of Japan,2014,134(6):707-713.

[16] Bowen WD,Moses EL,Tolentino PJ,et al.Metabolites of haloperidol display preferential activity at sigma receptors compared to dopamine D-2 receptors[J].Eur J Pharmacol,1990,177(3):111-118.

[17] Okuyama S,Imagawa Y,Ogawa S,et al.NE-100,a novel sigma receptor ligand:in vivo tests[J].Life Sci,1993,53(18):PL285-290.

[18] de Cavanagh EM,Ferder M,Inserra F,et al.Angiotensin Ⅱ,mitochondria,cytoskeletal,and extracellular matrix connections:an integrating viewpoint[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2009,296(3):H550-558.

[19] Shinoda Y,Tagashira H,Bhuiyan MS,et al.Haloperidol aggravates transverse aortic constriction-induced heart failure via mitochondrial dysfunction[J].J Pharmacol Sci,2016,131(3):172-183.