IC指纹图谱测定婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖

张志国，孙亚范，田玉新，张泽高，何清毅

（1.唐山三元食品有限公司，河北唐山301501；2.天津市乳品食品监测中心，天津300381）

低聚半乳糖在人体内不能被消化吸收，直接进入大肠被肠道双歧杆菌利用，促进双歧杆菌增殖，因此被定义为益生元。低聚半乳糖能有效促进人体肠道内的双歧杆菌增殖，促进钙、铁吸收，有助于肠道健康，通过双歧杆菌增殖合成B族维生素提供营养，改善脂质代谢，提高人体免疫力等多种生理功能[1-2]。

作为功能性低聚糖，我国允许食品企业将低聚半乳糖添加在婴幼儿食品中[3]。目前大多数婴幼儿配方奶粉生产企业都在自己的婴幼儿配方奶粉中添加了不同含量的低聚半乳糖，作为产品宣传点[4-6]。

在实际生产过程中由于低聚半乳糖成分复杂，没有合适的检验方法标准和对照品进行定量检测，给企业进行研发、生产质量管理带来困难。利用离子色谱法构建低聚半乳糖指纹图谱的高分离效率和高灵敏度的优点[7]，通过分析低聚半乳糖指纹图谱的特征，参考中药领域中指纹图谱技术的研究与应用[8-10]，选择特征组分完成婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量的测定，为婴幼儿配方奶粉的质量控制提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

低聚半乳糖：唐山三元食品有限公司；β-半乳糖苷酶（12 U/mg，500 kU/瓶）、乙酸钠（99%）、氢氧化钠（50%，1.515 g/mL）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；乙腈（色谱纯）：天津市天昊化工有限公司；磷酸二氢钾（色谱纯）、三水磷酸氢二钾（色谱纯）、十二水磷酸氢二钠（色谱纯）、氢氧化钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高效离子色谱仪（ICS-5000，配脉冲安培检测器PAD）、CarboPacPA200保护柱（3 mm×50 mm）、CarboPac PA200分析柱（3 mm×250 mm）：美国赛默飞公司；反相固相萃取柱（填料为苯乙烯二乙烯基苯，2.5 mL）、微孔滤膜（水相，0.22 μm）：天津博纳艾杰尔科技有限公司；Millipore超纯水处理装置：密理博中国有限公司；恒温水浴摇床（控温精度±1℃）、离心机（转速≥3 000 r/min）、精密 pH 仪（PHS-3C）：上海精密仪器仪表有限公司；分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂配制

1）磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.0）：22.0 g 磷酸二氢钾和6.0 g三水磷酸氢二钾溶于水中，稀释至1 L。120℃高压灭菌器中灭菌30 min。

2）盐酸溶液（1 mol/L）：量取 83.0 mL浓盐酸溶于超纯水中，稀释至1 L。

3）氢氧化钠溶液（1 mol/L）：称取40.0 g氢氧化钠，用100 mL无二氧化碳超纯水溶解，转移至1 L容量瓶中，用无二氧化碳超纯水定容至刻度，储存在具胶塞试剂瓶中。

4）β-半乳糖苷酶溶液（2 000 U/mL）：称取活性约为12 U/mg的来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的半乳糖苷酶16.67g，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液制成100 mL、半乳糖苷酶最终活性为2 000 U/mL的溶液。在pH 4.5和25℃条件下，1个单位可将1.0 mol o-硝基苯基-D-半乳糖苷水解为o-硝基苯酚和D-半乳糖。混悬液不用时储存于冰箱中。使用前充分振摇混悬液。酶混悬液制备后8 h内使用。

5）乙腈溶液（20%）：量取200 mL乙腈，转移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

6）乙腈溶液（3%）：量取30 mL乙腈，转移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度。

7）氢氧化钠溶液（250 mmol/L/L）：量取 50%氢氧化钠溶液13.2 mL，转移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度，通入氮气保护室温下可放置7 d。

8）乙酸钠溶液（100 mmol/L/L）：精密称取乙酸钠8.2 g，用无二氧化碳超纯水100 mL溶解转移至1 L容量瓶中，用水定容至刻度，通入氮气保护室温下可放置7 d。

9）氢氧化钠（100 mmol/L）、乙酸钠（1 mol/L）混合溶液：称取4.0 g氢氧化钠和82.0 g乙酸钠（精确至0.001 g），用水稀释至1 L，通入氮气保护室温下可放置7 d。

10）低聚半乳糖对照品贮备溶液（1 500 mg/L）：精确称取约0.331 g（精确至0.1 mg，换算成低聚半乳糖含量为1 500 mg）低聚半乳糖糖浆于50 mL烧杯中，加入约10 mL水，待糖浆溶解后，用水稀释至100 mL容量瓶中，摇匀。

11）低聚半乳糖对照品工作溶液：取适量低聚半乳糖对照品贮备液，用水配制称质量浓度为15、30、60、90 mg/L的标准曲线工作溶液。

1.3.2 样品处理

精密称取奶粉样品1.000 0 g（精确至0.000 1 g，含低聚半乳糖 500 mg/100 g～4 000 mg/100 g），置于 100 mL容量瓶中，加水40 mL，振摇使其溶解，60℃水浴10 min。放至室温后，加乙腈至刻度，摇匀。静置10 min，取上清液进行离心，1 000 r/min离心10 min。取离心上清液1.0 mL，加水稀释至10 mL，摇匀，取溶液过0.22 μm滤膜，取过滤膜的滤液5.0 mL过反相固相萃取柱，滤液备用。

1.3.3 离子色谱条件

1）色谱柱：CarboPac PA20分析柱（3 mm×250 mm），保护柱CarboPac PA20保护柱（3 mm×50 mm）；

2）色谱柱温度：30℃；

3）流动相：A：氢氧化钠溶液（250 mmol/L）；B：乙酸钠溶液（100 mmol/L）；C：氢氧化钠溶液（100 mmol/L）乙酸钠溶液（1 mol/L）混合溶液；D：水。梯度洗脱条件见表1。

4）PAD 灵敏度：3 μC；

5）进样量：10 μL；

6）检测池温度：30℃；

7）在正式进样检测前，按照梯度洗脱模式运行，当基线稳定后即可进样。

采用CarboPac PA20分析柱分析低聚半乳糖的流动相梯度见表1。

表1 采用CarboPac PA20分析柱分析低聚半乳糖的流动相梯度Table 1 Eluent gradient of galactooligosaccharides analyzed by CarboPac PA20 analytical column with IC

1.3.4 样品处理

1）低聚半乳糖定性分析

根据低聚半乳糖原料的指纹图谱识别出3个～5个低聚半乳糖的特征组分色谱峰，与奶粉样品中的低聚半乳糖的特征组分色谱峰作比较，确定样品中低聚半乳糖组分。

2）样品中低聚半乳糖含量计算公式

式中：X为试样中低聚半乳糖的含量，mg/100 g；C为从标准曲线上计算出的样品的浓度，mg/L；V为试样的稀释体积，mL；m为试样的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 指纹图谱法测定奶粉中低聚半乳糖含量的原理

目前，低聚半乳糖的检测方法标准只有AOAC 45.4.12-2001.02《Determination of trans-Galactooligosaccharides（TGOS）in Selected Food Products》标准，我们国家还没有发布低聚半乳糖检测方法的国家或行业标准。而且AOAC 45.4.12-2001.02标准不适用于乳糖含量高的奶粉样品[11]。

而且，低聚半乳糖生产工艺的差别对低聚半乳糖组分和比例的影响很大，形成不同公司低聚半乳糖组分的复杂性，因此使用外标方法检测存在难度。考虑到同一公司在生产工艺上的一致性，利用同一批次的低聚半乳糖原料作为已知含量的标准样品，通过选择原料中低聚半乳糖指纹图谱中的特征组分[7]，利用特征组分测定奶粉样品中的低聚半乳糖含量。对照品中低聚半乳糖含量依据AOAC 45.4.12-2001.02标准[12]和HPLC双柱法测定低聚半乳糖平均聚合度[13]两个方法进行测定，得到对照品中低聚半乳糖的含量。

2.2 低聚半乳糖指纹图谱特征组分的选择

按照1.3.3的离子色谱条件构建低聚半乳糖的指纹图谱，再按照AOAC 45.4.12-2001.02标准[12]中低聚半乳糖测定方法中的水解步骤，确定对照品中各个低聚半乳糖的组分，将确定的低聚半乳糖组分按照保留时间先后的顺序编号（将分离完全的低聚半乳糖组分单独编号，将低聚半乳糖组分不能够完全分离但是与干扰物质完全分离的重叠低聚半乳糖组分按照一个组分编号），再按照编号组分的色谱响应值从高到低的顺序编号，选择与干扰物质分离效果较好、色谱响应值较高的3个～5个低聚半乳糖组分作为特征组分，用作婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量的测定[7，14]。产品测定使用对应原料作为对照品进行低聚半乳糖组分定性和外标法定量（用特征组分的色谱峰面积表示测得的对照品中低聚半乳糖含量）。低聚半乳糖对照品的色谱图分析见图1，婴儿配方奶粉中低聚半乳糖的色谱图分析见图2。

2.3 检出限和线性范围

利用已知低聚半乳糖含量的对照品进行测试，当称样量为1.0 g时，检出限为2.5 g/kg，定量限为5.0 g/kg，线性范围为 4.0 g/kg～64.5 g/kg。

图1 低聚半乳糖对照品的分离结果Fig.1 Isolation of standard galactooligosaccharides

图2 婴儿配方奶粉中低聚半乳糖的分离结果Fig.2 Isolation of galactooligosaccharides in milk powder

2.4 回收率试验

称取同一个婴儿配方奶粉18个，分3个水平加入已知含量的低聚半乳糖糖浆溶液，每个加标水平平行测定6次，进行方法的回收率和精密度的测定。按照1.3.1中的按照1.3.2中的样品处理方法制备样品溶液，按照1.3.3中的离子色谱条件进行分析，计算回收率和精密度结果，结果见表2。

结果表明，3个水平的加标回收率在94.0%～106.7%之间，相对标准偏差为1.2%～2.8%，结果表明指纹图谱法测定低聚半乳糖方法的准确度和精密度满足婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量测定的需要。

2.5 重复性试验

利用添加了低聚半乳糖的婴幼儿配方奶粉进行重复性试验，准确称取7份添加了低聚半乳糖的婴幼儿配方奶粉（同一个样品）各0.5 g，按照1.3.1中的按照1.3.2中的样品处理方法制备样品溶液，按照1.3.3中的离子色谱条件进行分析，计算重复测定结果，结果见表3。

从表3中可以看出，分别对3个婴幼儿配方奶粉样品进行的7次重复测定结果，RSD值分别为2.50%、1.78%、2.44%，结果表明指纹图谱法测定婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖方法重现性良好。

表2 方法的回收率及相对标准偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method

表3 方法的精密度试验Table 3 The tests for precision of the method

3 结论

IC指纹图谱测定婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量，样品前处理简单、快速，不用购买复杂的标准样品，方法的重复性、准确度、精密度满足婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量测定的需要，解决了不同企业生产的低聚半乳糖组分复杂不易检测的技术难点，实现了婴幼儿配方奶粉中低聚半乳糖含量的测定。

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