氯霉素分子印迹聚合物的制备及性能研究

陈洁忠，周会艳，张琳

（济源职业技术学院济源市基础药理研究重点实验室，河南济源459000）

氯霉素（chloramphenicol，CAP）属于酰胺醇类抗生素，是一种广谱高效抗菌药，可有效抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，具有显著的抗菌作用和药物代谢动力学特性，价格低廉，广泛应用于各种传染性疾病的治疗[1]。由于其对人体的免疫系统和造血系统具有严重的毒副作用[2]，目前禁止氯霉素用于动物性食品和水产品中，国际上已明确规定氯霉素在牛奶和动源性食品中零残留限量的标准[3]。

对氯霉素的残留检测方法主要包括微生物法、免疫分析法、色谱法、超临界流体色谱法和毛细管电泳法等，但这些方法自身都有不可避免的缺点[4-7]。如高效液相色谱法最低检测限较高，需经过复杂的样品预处理过程；酶联免疫法的测定结果有较高的假阳率且不能用于现场检测。分子印迹技术是一种基于抗原-抗体理论，在生物化学、高分子化学、材料科学等多门学科的基础上形成的新型技术[8-9]。利用分子印迹技术制备的分子印迹聚合物对特定模板分子具有较高的特异性识别能力，能将干扰物杂质较为彻底的去除，能够准确识别待测目标化合物[10-12]。然而传统分子印迹聚合物的制备方法存在传质较慢、结合效率低和模板分子泄露等问题[13-14]。由于表面分子印迹技术（surface molecular imprinted technique，SMIT）是将模板分子与功能单体在溶剂中反应所形成的复合物接枝到表面经过活化修饰的硅胶、玻璃等介质表面上，然后再加入引发剂进行印迹聚合反应而制得，该方法是在聚合物的表面建立印迹位点，可以有效克服传统聚合方法中的问题[15-18]。

近年来研究发现以表面聚合法制备的聚合物具有特异的选择性、更易接近的结合位点、快速的传质速率和较高的结合动力学等优点[19-20]。因此，采用SMIT制备氯霉素分子印迹聚合物，并研究其吸附性能，对检测生物样品中残留的微量氯霉素，进一步保障食品安全，维护环境生态，促进人体健康具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氯霉素（chloramphenicol，CAP）：西安仁达生物医药有限公司；乙二酸二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EDMA）：美国 Sigma公司；球形硅胶：日本东京株式会社；3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）：北京百灵威公司，纯度98%；（分析纯）甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）：天津市化学试剂研究所；（化学纯）偶氮二异丁腈（2，2’-azodiisobutyronitrile，AIBN）：上海试剂四厂；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸（分析纯）：西安化学试剂厂；甲苯（分析纯）：天津市双船化学试剂厂；甲醇、乙腈（色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司；盐酸、三乙胺、丙酮、冰醋酸（分析纯）：天津耀华化学试剂有限公司。

SHIMADZU色谱系统（包括：LC-20A泵、SPD-20A紫外检测器、CS-Light实时分析色谱工作站）、AUY220型电子天平：日本岛津公司；METTLERTOLEDO FE20/EL20 PH计：德国梅特勒-托利多集团；XK96-A快速混匀器：姜堰市新康医疗器械有限公司；JSM-6390A型扫描电子显微镜：日本电子株式会社。

1.2 方法

1.2.1 硅胶的活化及改性

称取球型硅胶12 g分散于100 mL 10%HCl溶液中，110℃加热搅拌回流24 h后用大量蒸馏水洗至中性，60℃干燥24 h后得到活化硅胶，备用。称取活化硅胶5 g于100 mL圆底烧瓶中，依次加入50 mL甲苯、2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和1 mL三乙胺，110℃加热搅拌回流24 h。反应后用甲醇多次减压抽滤以除去未反应的试剂，60℃干燥24 h即得改性硅胶。

1.2.2 氯霉素分子印迹聚合物的制备

称取CAP 0.1719 g（0.5 mmol）于50 mL锥形瓶中，加10 mL甲醇超声溶解后加入10 mL乙腈，168 μL功能单体MAA（1∶4，摩尔比），2 g改性硅胶，室温下搅拌过夜以进行预组装。然后加入952 μL交联剂EDMA（交联度85%）和0.016 4 g引发剂AIBN，超声搅拌20 min后向溶液中通入氮气20 min，将锥形瓶密封，60℃水浴搅拌反应24 h。反应结束后将反应产物减压抽滤，并用大量甲醇洗涤，以除去未反应的试剂，用丙酮漂洗，以除去细小的聚合物碎片。以甲醇-冰醋酸（4∶1，体积比）为提取液索氏提取24 h以除去模板分子。依次用乙腈-水（20∶80，体积比）、甲醇洗至中性，60℃真空干燥24 h后得到氯霉素表面分子印迹聚合物（surface molecularly imprinted polymers，SMIPs）。空白印迹聚合物（surface non-imprinted polymers，SNIPs），除不加入模板分子外，均按照上述方法平行操作。

1.2.3 改性硅胶和SMIPs的形态表征

分别取一定量的改性硅胶和SMIPs，烘箱60℃干燥24 h，样品喷金后，通过扫描电子显微镜对其进行形态表征。

1.2.4 等温吸附性能研究

精密称取SMIPs和SNIPs各20.0 mg于10 mL锥形瓶中，分别依次加入10 mL浓度为900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、20 μg/mL 的 CAP 水溶液，室温下振荡吸附2 h，吸取上清液经微孔滤膜滤过后采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定。色谱条件：流动相：甲醇-（0.065 mol/L，pH5.8）磷酸盐缓冲溶液（70∶30，体积比）；流速：0.8 mL/min；检测波长：277 nm；进样量：20 μL；柱温：25 ℃。

1.2.5 吸附动力学研究

精密称取SMIPs和SNIPs各20.0 mg于10 mL锥形瓶中，分别加入10 mL浓度为700 μg/mL的CAP水溶液，室温下进行振荡吸附 0.5、1、2、5、10、15、20 min，吸取上清液经微孔滤膜滤过后采用HPLC法测定。色谱条件：流动相 ∶甲醇-（0.065 mol/L，pH5.8）磷酸盐缓冲溶液（70∶30，体积比）；流速：0.8 mL/min；检测波长：277 nm；进样量：20 μL；柱温：25 ℃。

2 结果与讨论

2.1 改性硅胶和SMIPs的形态表征

改性硅胶和SMIPs的扫描电镜图见图1。

图1 改性硅胶和SMIPs的电镜扫描图Fig.1 SEM of modified silica particles and SMIPs

从图1中可看出改性硅胶表面较光滑平整，而SMIPs表面较粗糙，覆盖有聚合物层，形貌的变化说明印迹聚合物已接枝到硅胶表面，试验成功制备了以硅胶为基质的分子印迹聚合物。

2.2 SMIPs和SNIPs等温吸附性能研究

氯霉素分子印迹聚合物等温吸附曲线见图2。

图2 氯霉素分子印迹聚合物等温吸附曲线Fig.2 CAP SMIPs isothermal adsorption curve

从图2中可以看出，SMIPs与SNIPs对模板分子CAP的吸附量均随着CAP浓度的升高而增大，但是SMIPs对CAP的吸附量显著大于SNIPs，原因是在聚合过程中由于模板分子的存在，使聚合物内部形成了与模板分子能够进行特异性结合的三维孔穴结构，该结构对模板分子的结构类似物也有一定的特异性吸附能力，在吸附起始阶段聚合物的结合位点处于空置的状态，因此吸附向正方向进行，表现为随着CAP浓度的增加，SMIPs与SNIPs对CAP的吸附量呈现出增长的趋势。当CAP的浓度增大到一定值时，SMIPs与SNIPs对CAP的吸附量达到饱和，SMIPs的饱和吸附量为 51 μg/mg，SNIPs的饱和吸附量为 17 μg/mg。这是因为在吸附过程中，聚合物的结合位点逐渐饱和，从而聚合物的吸附达到了平衡，曲线上表现为较平坦。

根据结合前后溶液中CAP的浓度变化计算SMIPs（或 SNIPs）对 CAP的结合量 Q，以 Q/C对 Q作图即得到Scatchard图见图3。

如图3所示：SMIPs中Q/C对Q呈明显的非线形关系，表明SMIPs对模板分子CAP存在不同的结合位点。图中两条直线均呈现出较好的线性关系，表明在本试验的浓度范围内，SMIPs存在两种不同的结合位点，一类为结合力强的高亲和力位点，另一类为结合力弱的低亲和力点。

图3 Scatchard模型分析图Fig.3 Scatchard model analysis diagram

2.3 SMIPs和SNIPs吸附动力学研究

通过吸附动力学分析来考察SMIPs对模板分子CAP达到吸附平衡所需的时间，结果如图4所示。

图4 SMIPs和SNIPs对氯霉素的吸附动力学曲线Fig.4 Adsorption kinetic curves of SMIPs and SNIPs on chloramphenicol

从图4中可看出，SMIPs与SNIPs对模板分子CAP的吸附量均随着吸附时间的增加而增大，但是SMIPs对CAP的吸附量显著大于SNIPs，2 min时即可达到吸附平衡。这是由于在吸附的起始阶段，位于SMIPs表面的结合位点首先与CAP进行特异性结合，当位于表面的结合位点达到饱和时，位于聚合物内部的结合位点开始进行特异性吸附，此时吸附速率降低，当结合位点达到饱和后吸附达到平衡。SMIPs只需2 min即可达到吸附平衡，表明合成的印迹聚合物与模板分子之间有快速的传质速率和结合动力学。

3 结论

以硅胶为基质，利用SMIT制备的SMIPs，吸附动力学研究结果显示吸附达到平衡的时间为2 min；等温吸附研究结果表明SMIPs对氯霉素的最大吸附量为51 μg/mg，SNIPs对氯霉素的最大吸附量为 17 μg/mg，SMIPs对氯霉素的吸附量明显高于 SNIPs，经Scatchard分析，SMIPs主要存在两类不同的结合位点与氯霉素进行作用。由此可见，SMIPs具有较好的机械性能，结合位点较多位于聚合物的表面，使模板分子易于洗脱，提高了吸附容量和传质速率，克服了传统方法的缺点，有利于检测动物源性食品中的氯霉素是否符合标准。

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