蝎毒多肽对慢性粒细胞白血病细胞Hh通路下游活化因子Gli1表达的影响

张伟锋，杨文华

(天津中医药大学第一附属医院，天津300381)

目前以伊马替尼为代表的分子靶向药物治疗慢性粒细胞白血病(CML)取得了良好疗效，但部分患者存在药物不耐受及耐药现象[1,2]。全蝎为一味传统中药，目前已用于多种肿瘤的治疗[3]。蝎毒多肽是从蝎尾毒液中提取的多肽混合物，是中药全蝎的有效成分。研究证实，蝎毒多肽能诱导白血病细胞凋亡，可通过抑制白血病细胞的黏附力及侵袭力抑制白血病细胞髓外浸润[4,5]；逆转白血病干细胞的多药耐药[6,7]；抑制CML细胞增殖，并可通过抑制Hedgehog通路(Hh通路)上游活化因子表达，抑制CML的病情进展。2015年10月～2016年12月，本研究观察了蝎毒多肽对慢性粒细胞白血病细胞Hh通路下游活化因子Gli1表达的影响，现分析结果并探讨其最佳剂量。

1 材料与方法

1.1 材料 人慢性粒细胞白血病细胞K562由中国医学科学院血液学研究所提供。蝎毒多肽系将蝎毒粗毒应用分子筛层析技术提纯所得，真空干燥后制成干粉，为分子量6 000～7 000的多肽混合物，纯度为89.1%。伊马替尼粉剂由中国医学科学院血液学研究所提供，使用前用生理盐水溶解，针头式滤器过滤除菌，稀释到所需浓度。RPMI 1640、FBS(美国Gibco公司)；TRIzolkit、PCR试剂盒及SYBRGreen荧光燃料MIX(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit(美国MBI公司)，兔抗人Gli1抗体、β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，HRP标记的二抗试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，PVDF膜(孔径为0.22 μm，美国Millipore公司)，医用X射线胶片(美国柯达公司)。培养瓶、96孔培养板(美国Corning Incorporated公司)、超净工作台(江苏苏净集团有限公司)、5%CO2恒温培养箱(美国Thermo Forma公司)、倒置显微镜(日本Olympus公司)、电子天平(德国Sartorius公司)、微量加样器(美国Gilson公司)、酶标仪(美国BIO-RAD公司)、低温离心机(美国Sigma公司)。

1.2 K562细胞分组及蝎毒多肽干预 常规复苏冻存的K562细胞，37 ℃、5% CO2条件下用完全培养基常规培养，3～4 天传代1次。收集对数生长期细胞以1×105个/mL密度接种于24孔板，每孔细胞悬液200 μL。随机分为蝎毒多肽1、2、3组和伊马替尼组、空白对照组，每组3孔。蝎毒多肽1、2、3组分别加入10、20、40 μg/mL的蝎毒多肽20 μL，伊马替尼组加入2 mg/mL的伊马替尼20 μL，空白对照组加入生理盐水20 μL，继续培养48 h。

1.3 K562细胞Gli1 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取各组上述细胞，吹打后吸取细胞悬液，置于无菌、无RNase的2 mL EP管中，1 800 r/min离心5 min，用DEPC水配制的1×PBS 洗2次，轻柔悬浮细胞，调节细胞密度调整为5.0×105个/mL，用TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，将获得的cDNA模板稀释后行实时荧光定量PCR。引物设计：Gli1正向引物5′-GGCTGGACCAGCTACATCAAC-3′，反向引物5′-TGGTACCGGTGTGGGACAA-3′；β-actin正向引物5′-CGTGCTGCTGACCGAGG-3′，反向引物 5′-GAAGGTCTCAAACATGATCTGGGT-3′。反应体系共20 μL，包括PCR Mixes 10 μL、10 μmol/L的PCR正向引物0.5 μL、10 μmol/L的PCR反向引物0.5 μL、cDNA模板2 μL、dH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸5 min。以β-actin为内参，用2-ΔΔCt法计算Gli1 mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 K562细胞Gli1蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组上述细胞，1 000 r/min离心5 min，1 mL冷PBS重悬计数。用冷PBS洗涤沉淀2次，1 000 r/min离心5 min并转移至1.5 mL的EP管。每1×106个细胞加入100 μL细胞裂解液，混匀后冰浴放置30 min。4 ℃下12 000 r/min离心10 min。取上清，用BCA法进行蛋白定量。将蛋白样品充分变性后进行SDS-PAGE。由泳结束，将电泳产物转印至PVDF膜，0.5%脱脂牛奶室温封闭膜60 min，分别加入相应一抗4 ℃孵育过夜，1×TEST洗膜3次，加入二抗室温孵育60 min，1×TBST洗膜3次，加ECL显影。以β-actin为内参照。用Gli1蛋白电泳条带灰度值与内参β-actin蛋白电泳条带灰度值之比作为Gli1蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

蝎蝎毒多肽1组Gli1 mRNA和相对表达量与空白对照组比较P>0.05。蝎毒多肽2、3组及伊马替尼组Gli1 mRNA和蛋白相对表达量明显低于蝎毒多肽1组及空白对照组(P均<0.05)。蝎毒多肽2、3组及伊马替尼组Gli1 mRNA和蛋白相对表达量组间两两比较P均>0.05。见表1。

表1 各组Gli1 mRNA和Gli1蛋白相对表达量比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与蝎毒多肽1组比较，△P<0.05。

3 讨论

研究证实，K562细胞具有Ph染色体和Bcr/abl融合基因的特征性标志[8]，而酪氨酸激酶abl的异常增高是CML的主要发病机制[9]，临床上已经将此特征作为CML诊疗的重要依据。Hh通路活化主要发生于胚胎发育过程中，此后逐渐失去活性。Hh 通路是由上游的Hh 配体、膜蛋白受体和下游的核转录因子及靶基因组成[10]，存在Hh配体时，配体与膜蛋白受体结合，信号向细胞内传递，激活核转录因子Gli基因家族，导致Hh通路被激活[11]。研究发现，Hh 通路的异常激活可导致多种肿瘤的发生[12]；CML细胞旺盛的增殖能力和病程显著的时相性与胚胎时期的造血细胞存在着一定相似性[13]。Irvine等[14]研究表明，Hh通路与CML的发病有关，Hh通路抑制剂可通过靶向CML干/祖细胞，提高CML的治疗反应。有研究发现，Hh通路与CML的发病和耐药相关[15]。本课题组研究已证实，上游Hh 配体以及smo、ptch受体基因的mRNA和蛋白在K562细胞中存在高表达。本研究从基因和蛋白两个层面观察了蝎毒多肽对K562细胞Hh通路下游活化因子Gli1表达的影响，结果显示，蝎毒多肽2、3组干预后Gli1 mRNA和蛋白表达均明显下降，其Gli1 mRNA和蛋白相对表达量与伊马替尼组相当，进一步说明蝎毒多肽可通过调控Hh通路治疗CML，且治疗效果与靶向药物伊马替尼相当。考虑到蝎毒多肽比伊马替尼的价格低，笔者认为蝎毒多肽在CML治疗方面具有较好的应用前景。本研究结果显示，蝎毒多肽1组Gli1 mRNA和蛋白相对表达量与空白对照组相当，表明10 μg/mL的蝎毒多肽不足以导致K562细胞Gli1 mRNA和蛋白相对表达量明显变化，这为今后蝎毒多肽治疗CML最低起效剂量的研究积累了资料。

综上所述，20～40 μg/mL的蝎毒多肽可明显抑制CML细胞Gli1基因表达。提示Gli1基因有可能成为蝎毒多肽治疗CML的靶点，其更多的作用靶点或信号通路仍有待进一步深入研究。

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