王琪月 孟淑君 张 柯 张战辉 汤继华 丁 冬,*
玉米雌穗发育杂种优势相关miRNA的研究
王琪月1孟淑君1张 柯2张战辉1汤继华1丁 冬1,*
1河南农业大学农学院/ 省部共建小麦玉米作物学国家重点实验室, 河南郑州 450002;2河南省农业科学院, 河南郑州 450002
杂种优势已广泛应用于玉米育种, 在提高玉米产量、品质以及增强抗逆性等方面起到了重要的作用, 然而杂种优势的分子机制尚不清楚。植物miRNA主要在转录和转录后水平调节基因的表达。为阐明miRNA是否及如何对玉米雌穗发育杂种优势产生影响, 本研究对玉米杂交种郑单958及其亲本自交系(昌7-2和郑58)进行了高通量miRNA测序和降解组测序。取玉米雌穗花序分生组织(IM)发育为成对小穗分生组织(SPM), 进而产生小穗分生组织(SM), 及小花分生组织(FM)将3个不同时期的雌穗样品用于miRNA建库测序, 鉴定出16个miRNA家族中的81个保守miRNA为非加性表达, 认为是与雌穗发育杂种优势形成相关的miRNA; 3个阶段中分别检测到80.30%、56.06%和48.10%的非加性表达的miRNA被显性或超显性抑制。鉴定出8种新的miRNA, 属于7个miRNA家族。通过雌穗降解组测序, 发现在郑单958及其亲本自交系中共同检测到的miRNA靶向42个基因的82个转录本。根据测序结果构建了miRNA参与玉米雌穗杂种优势的模型, 并推测在雌穗发育早期阶段杂交种雌穗的miRNA的普遍抑制导致其靶基因上调表达, 随着发育进程miRNA逐步解除抑制, 带来其靶基因表达量的逐步减少, 这种miRNA与其靶基因的拮抗关系也许与玉米雌穗发育杂种优势形成有关。
雌穗发育; 杂种优势; miRNA; 降解组测序; 玉米
杂种优势即F1杂交种产量、品质、抗逆等性状均优于其纯合亲本系的生物学现象[1]。目前, 杂种优势虽然已经成功运用于作物育种并提高了作物产量, 但其分子机制尚未完全解析。根据等位基因互作的原理, 前人提出显性、拟显性和超显性假说[2]3种主要理论来解释杂种优势遗传基础。近年来, 随着高通量技术的发展, 非等位基因间互作同样被认为是产生杂种优势的原因, 并据此提出了上位性[3]和基因调控网络假说[4]。
玉米作为世界上重要的禾谷类作物, 不仅为人类和动物提供食材, 还可以作为工业原料用于生产乙醇。由于玉米在表型、等位基因[5]、转录[6]和翻译[7]水平上丰富的变异, 以及有已测序的参考基因组信息, 可作为探索杂种优势遗传机制的理想模式作物[5]。
miRNA是长度为18~25 nt的非编码内源小分子RNA, 在转录后水平起到关键的基因表达调控作用[8]。植物miRNA与其靶向mRNA完全或近乎完全地互补配对, 会引起靶向mRNA断裂, 导致基因沉默[9]。miRNA调控参与多种生物学进程, 如器官分化[10]、叶生长[11]、性别决定[12]、逆境胁迫[13]和雌雄不育[14]。在H99×B73杂交种与其亲本自交系授粉10 d后的籽粒样品中, 发现miR167被过度诱导, 表明miRNA可能参与玉米杂种优势相关基因的调控[15]。Ding等[16]基于高通量测序数据, 发现大多数保守的玉米miRNA在玉米杂交种胚中较其亲本自交系丰度低, 提出在杂交种中miRNA的普遍抑制可能是产生玉米胚萌发杂种优势的原因之一。
高通量测序技术(high throughput sequencing)可对DNA或RNA分子精确测序, 从而能够对某一物种的基因组进行全貌分析。高通量测序技术已经广泛应用于基因组学、表观基因组学以及功能基因组学研究的许多方面[17]。降解组测序是一种新的鉴定miRNA靶基因的实验方法。它综合了高通量测序技术与生物信息学分析两者的优势, 对植物体中由miRNA介导而产生的mRNA降解片段深度测序分析, 从而高效、准确地筛选出与之相对应的靶基因。降解组测序已成功应用于鉴定细胞质雄性不育(CMS)[18], 棉花体细胞胚发生[19]和玉米胚性愈伤组织[20]miRNA的靶基因等研究中。Zhang等[21]报道基于自交系B73的miRNA文库深度测序, 认为miRNA测序和降解组测序结合的方法是识别miRNA靶标的可靠方法。
玉米雌穗分化可分为4个阶段。从营养生长转向生殖生长时, 位于植株顶端的顶端分生组织(SAM)转化成花序分生组织(IM); 随着IM的膨大和伸长, 形成多行排列整齐的分生组织, 即成对小穗分生组织(SPM); 每一个SPM进而分化出两个短分枝的小穗分生组织(SM); 每个SM分化出两个小花分生组织(FM)[22]。玉米雌穗产量相关性状, 包括穗行数、穗长和粒重都具有杂种优势, 第3阶段决定穗粒行数和穗长。玉米花序形态与籽粒产量之间有明显联系。研究推测关键调控基因在表达时间、表达位置、表达水平的变化可以解释玉米和其他禾本科作物的结构和遗传差异[23]。Chuck等[12]研究表明编码玉米miRNA156的通过靶向AP2结构域转录因子来决定玉米性别分化和分生组织细胞分裂能力。玉米雌穗发育中的SPM至SM阶段对miRNA的深度测序表明, miRNA普遍参与玉米雌穗的发育[24], 然而miRNA影响雌穗发育杂种优势的机制仍不清楚。
本研究对中国大面积种植的玉米杂交种郑单958及其亲本自交系昌7-2和郑58进行高通量深度测序, 以期获得与雌穗发育杂种优势相关的miRNA。结果表明, miRNA参与雌穗发育, 尤其是雌穗细胞分化早期阶段发育的杂种优势形成。通过降解组测序鉴定了miRNA的靶基因, 并结合miRNA和降解组测序构建了玉米雌穗发育中杂种优势可能的miRNA调控途径。
玉米杂交种郑单958及其亲本自交系材料(昌7-2和郑58)各40株种植于河南农业大学农业实验基地(河南郑州, 34°48' N, 113°42' E)。年平均气温14.3℃, 年降水量640.9 mm。待叶龄指数达到50%以上(6~8片展开叶), 剥开第一穗位雌穗于显微镜下观察其外部形态。IM至SPM时期的显著特点是可以看到生长锥长度大于宽度且在其基部出现了突起; SPM至SM时期显著特点是雌穗中部开始出现小穗裂片, 由小穗裂片分化成两个成对的小穗, 呈两列突起状; FM时期显著特点是小穗突起上会出现两个突起的小花。分别取IM至SPM时期和SPM至SM时期, 以及FM形成时期3个阶段的雌穗样品以液氮速冻备用。采用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取雌穗材料总RNA, 用于miRNA文库构建, 并分别取20 μg总RNA用于高通量测序(BGI, 北京)。
使用TRIzol试剂盒(Invitrogen, USA)提取雌穗总RNA, 使用15%PAGE胶分离不同片段大小的RNA, 取16~32 nt之间的条带, 回收小RNA; 对这些小RNA加上3'和5'接头; 反转录成cDNA, 经过几轮PCR扩增; 用PAGE胶对RT-PCR产物切胶回收, 溶于EB 溶液, 完成文库构建, 质检后用于高通量测序。对llumina测序所得的原始数据, 去除接头及低质量的测序片段获得高质量的测序片段之后, 除去长度小于16 nt的片段, 再比对基因组, 去除tRNA、rRNA等小分子量RNA。将初级分析得到的测序片段分类注释, 可以获得样品中包含的各组分及表达量信息, 排除所有注释后剩下的小RNA, 于miRBase数据库(http://www.miRBase.org/, Version 21;包括172个成熟的miRNA)中比对, 当测序片段与数据库中已知的miRNA序列错配小于2时, 认为该测序片段为保守的miRNA。另一方面, 利用软件Mireap (http://sourceforge.net/projects/mireap/)预测新的miRNA。判定一个小RNA是否为候选miRNA时要符合以下5个条件: (1)前体可形成茎环结构; (2) miRNA序列完全包含于茎环结构的一个臂; (3)发夹的另一臂上预测的成熟miRNA序列与其互补miRNA*序列之间不超过6个错配; (4) miRNA或miRNA*序列中不存在环或中断; (5)茎环前体最小自由能指数MFEI>0.85[25]。
为了判断样品之间miRNA的表达量差异, 将每个样品里的所有miRNA都进行归一化处理, 处理后如果某一miRNA在4个时期内的表达量都小于1RPM 则不予考虑[16], 将玉米雌穗杂种优势相关miRNA归类为6组[16]: (1) + +: 超高亲表达, 杂交种的表达量显著高于两个亲本自交系且杂交种的表达量和其亲本中高表达量亲本的差异超过10%; (2) +: 高亲表达, 杂交种的表达量高于其亲本, 杂交种的表达量和其亲本中高表达量亲本的差异低于10%; (3) +-: 加性表达, 杂交种的表达量介于2个亲本表达量之间, 且杂交种的表达量和其亲本的表达量中值的差异低于10%; (4)-: 低亲表达, 杂交种的表达量低于其亲本, 杂交种的表达量和其亲本中低表达量亲本的差异低于10%; (5)--: 超低的亲本表达, 杂交种的表达量显著低于其亲本, 杂交种的表达量和其亲本中低表达量亲本的差异超过10%; (6)显示出和前几种不同的表达模式(用“D”表示)与中亲值差异大于10%。
从每种材料取约20 µg总RNA混合样品用来制备降解组文库, RIN>7.0时, 采用Bioanalyzer 2100和RNA6000 Nano Lab Chip Kit (Agilent, CA, USA)分析总RNA质量和纯度。参考并改进前人报道的实验流程进行建库测序[26]: (1)使用约150 ng RNA加5¢接头, 然后将带接头的oligo(dT)将单链反转录成cDNA, 并采用生物素化标记的随机引物退火; (2)通过生物素化随机引物捕获Strapavidin RNA片段; (3) 5¢-端与仅含有5¢单磷酸酯的RNA结合; (4)逆转录和PCR; (5)仅对代表原始RNA的5¢端插入片段的前36个核苷酸测序。然后按照LC-BIO (中国杭州)提供的方案, 在IlluminaHiseq 2500上进行单端测序(36 bp)。通过Fisher精确检验、卡方2×2检验、卡方×检验、标准检验和ANOVA方差分析测定降解组数据水平差异, 设定每个检验的显著性阈值为0.01和0.05。
对杂交种郑单958及其亲本自交系昌7-2和郑58的发育中雌穗的miRNA的表达量进行分析, 以验证miRNA测序结果。选用8个保守miRNA引物对提取到的RNA采用茎环法[27]进行反转录, 对靶基因进行反转录, 用于RT-qPCR反应, 内参为玉米基因, 采用2–ΔΔCt方法计算相对表达量, RT-qPCR引物列于表1中, 设有3次技术重复。
通过对杂交种郑单958及其亲本自交系雌穗的小分子量RNA文库进行高通量测序, 来鉴定影响雌穗杂种优势的miRNA。对9个样本测序, 得到175 214 241个原始读数。每个样本平均为19 468 249个读数, 范围为17 410 285到22 869 631。平均每个样品为18 672 474个读数, 范围为16 909 865至22 244 845。测序所得的小 RNA几乎涵盖所有 RNA, 包括tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、siRNA、miRNA、外显子和内含子降解片段等, 通过去除接头及低质量的测序片段获得高质量的测序片段, 共有138 600 762个候选miRNA读数, 每个样本平均为15 400 084个, 范围为11 902 891至19 538 721。在9个样本中, 将候选miRNA与玉米B73基因组(RefGen_v3)比对, 21 nt的RNA最丰富, 占总量61.60%, 19 nt的RNA次之, 占总量15.51%, 这些miRNA代表玉米雌穗成熟miRNA的典型长度(图1)。
在杂交种和其亲本中检测到3个发育阶段分别有100、95和94个保守miRNA, 大多数miRNA在杂交种和其亲本自交系的雌穗发育过程中是非加性表达的。在IM至SPM阶段, SPM至SM阶段和FM阶段分别有83、80和87个差异表达的miRNA, 3个发育阶段均检测到的81个miRNA。将入选的81个玉米雌穗杂种优势相关miRNA分为5种类型: 3个雌穗发育阶段中分别有3、18和38个miRNA为超高亲表达(+ +); 10、11和2个miRNA为显性高亲表达(+); 15、15和3个miRNA为加性表达(+-); 0、9和2个miRNA在亲本系中为显性低亲表达(-); 53、28和36个miRNA为超低亲表达(--), 如表2所示。
表1 玉米雌穗杂种优势相关miRNA和其靶基因的检测引物序列
#代表降解组测序未检测到玉米miR168a/b的靶基因, 因此此靶基因为预测获得。
#represent the target genes of zma-miR168a/b were not found in the degradome sequencing data, so they were predicted.
图1 miRNA的长度分布
表2 共检测到的保守miRNA的表达趋势
(续表2)
IM: 雌穗花序分生组织; SPM: 成对小穗分生组织; SM: 小穗分生组织; FM: 小花分生组织。
IM: inflorescence meristem; SPM: spikelet pair meristem; SM: spikelet meristem; FM: flower meristem.
通过降解组测序来鉴定玉米雌穗样品的miRNA的靶基因。由于miRNA产生和目标mRNA降解之间可能存在延迟, 因此对所有3种材料的3个阶段的混合样品进行测序, 共检测出42个基因的82个转录本。miRNA-mRNA切割位点如表3所示, 对这些目标基因进一步进行GO功能注释分析, 表明雌穗中miRNA的目标基因侧重于编码转录因子(31/42)(表3)。
表3 降解组测序检测到的玉米雌穗杂种优势相关miRNA的靶基因
(续表3)
(续表3)
在自交系昌7-2、郑58和杂交种郑单958雌穗发育的3个阶段分别发现了216、174和203个miRNA与保守的miRNA不匹配, 但可形成如pre-miRNA茎环发卡结构的侧翼序列, 它们可作为候选的miRNA。在9个样品中共检测到27个候选的miRNA, 通过计算这27个miRNA的MFEI进一步提高预测精度, 其中有8个MFEI大于0.85, 这8个miRNA最有可能是新的玉米 miRNA。根据成熟miRNA序列, 将8种预测的新的miRNA分类为7个家族, 其序列、染色体位置和MFEIs如表4所示, 前体miRNA茎环结构见图2 (由MatLAB bio-tool创建)。这些新预测的miRNA都由茎环结构的前体剪切加工而来, 前体序列长度介于98~328 bp之间, 茎环前体最小自由能指数MFEI> 0.85, 成熟序列的长度为21 bp, 且对靶基因的抑制方式为直接剪切。有趣的是, 发现miR-7a和miR-7b具有相同的成熟miRNA序列, 并呈簇状分布在玉米第1染色体, 该特征与一些保守的成簇分布miRNA前体特征一致[28]。通过在线软件psRNA Target预测这8个新发现的玉米miRNA的靶基因, 共预测到49个miRNA的靶基因(表5), 基因预测时候参数全部使用默认值, 搜索的靶位点文库为玉米的全部Unigene序列。对这些靶基因进行GO功能注释分析(图3), 除了功能未知的基因外, 多为编码信号转导因子(6/49)的基因, 其次是编码应激反应蛋白的基因(4/49)。
表4 新的miRNA及其特性
IM: 雌穗花序分生组织; SPM: 成对小穗分生组织; SM: 小穗分生组织; FM: 小花分生组织; MFEI: 自由能指数。
IM: inflorescence meristem; SPM: spikelet pair meristem; SM: spikelet meristem; FM: flower meristem; MFEI: minimal free energy index.
图2 新的玉米miRNA的前体茎环结构
miR-n7a和miR-n7b享有共同的pre-miRNA和成熟miRNA序列, 它们的特征被各自的pre-miRNA的基因组位置所区分, 蓝色代表已配对, 红色表示未配对, 绿色代表成熟的新的miRNA。
miR-n7a and miR-n7b share the same pre-miRNA and mature miRNA sequences, the character that distinct them from each other is the genome location of each pre-miRNAs. The blue residues are paired, red ones are unpaired, and green strings show the mature novel miRNAs.
采用茎环法实时荧光定量的方法检测miR159、miR160、miR167、miR168、miR169、miR172a、miR172e和miR390这8个miRNA的表达趋势(图4)。使用方差分析来分析miRNA和其对应靶基因的RT-PCR的数据表明, 所选miRNA的相对表达量与深度测序数据相一致。根据miRNA的表达趋势(表2), miR390在雌穗发育过程中, 表达量是逐渐增加的, miR172a、miR172e在SPM至SM期大量表达, 这与我们的定量结果(图4)是一致的。
图3 新miRNA靶基因功能分类
图中数字表示基因个数。
The numbers show the number (s) of target genes.
自交系与其相应的F1杂交之间的表型差异与基因本身的功能、基因表达的时间、数量有关[29-30]。水稻、小麦和玉米在杂交种中比其亲本中检测到的表达下调的miRNA要多于表达上调的miRNA, 表明非加性表达的miRNA, 尤其是下调的miRNA可能与作物的杂种优势形成有关[31-32,16]。本研究发现, 杂交种郑单958在早期的IM至SPM的发育阶段中有很多miRNA被下调, 说明miRNA的负调控可能在玉米雌穗发育杂种优势中起着重要作用。此外, miRNA家族的非加性表达模式与玉米雌穗发育的杂种优势形成有关, 且在雌穗发育的过程中这种表达模式是变化的。在此研究基础上构建了miRNA对玉米雌穗发育的杂种优势的调控网络见图5。
图5 miRNA对玉米雌穗发育的杂种优势的调控网络
miRNA通过剪切靶mRNA或抑制蛋白质翻译来调节基因的表达。大多数miRNA的靶基因是转录因子(TFs), 如(miR156)[33]、(miR167)[34]、(miR164)[35]和(miR396)[36], 其作用是调节植物发育。玉米雌穗发育中miRNA的非加性表达模式是变化的, 杂交种雌穗早期发育阶段的miRNA靶基因较高水平的表达导致下游基因转录和翻译水平提高; 后期发育阶段中miRNA表达量的逐渐上升, 导致其靶基因抑制加强, 这可能是玉米雌穗发育性状杂种优势的形成原因之一。
前期研究显示,是miRNA-RISC的负反馈调节子, 是拟南芥ARGONAUTE家族的唯一成员, 参与miRNA定向的mRNA切割过程。AGO1体内稳态和AGO1对miR168的转录后稳定需要miR168和基因的共转录调节。miR168和其靶基因共调控miRNA的负反馈调控途径[37], 因为是miRNA通路的一个关键调节因子, 在雌穗发育早期的的mRNA表达变异可能导致miRNA活动改变。玉米miR168的表达可能抑制, 并以此影响多个其他miRNA的靶基因, 因此杂交种与亲代自交系相比, 其功能性基因种类更有可能多样化, 并且表达更加丰富。
玉米卷叶基因是拟南芥基因的同系物。ath-miR166介导的HD-Zip调节侧生器官背腹轴极性的建立和维持[38], 除了参与调节叶片极性[39],干旱和植物激素[40-41]等各种胁迫条件也能诱导HD-Zip家族的产生。测序表明高丰度的miRNA166成员在雌穗发育过程中被逐渐诱导, 在IM至SPM期降低, SPM至SM期逐步提高, 并在FM阶段被显著诱导。结合miR166成员的高拷贝数和其逐渐诱导模式, 表明HD-Zip转录因子(或许是)可能在杂合玉米雌穗发育中被逐渐抑制, 导致对植物激素的敏感性降低。
研究显示miRNA159通过编码和来调控种子休眠和发芽,和是水稻[42]和拟南芥中ABA响应的正向调控因子。ABA是植物成熟和发育的关键调节因子, 已被证明与许多植物的生物和非生物胁迫反应有关[43]。ABA可以诱导miR159的表达, 降低和的量, 进而降低ABA的敏感性[44], 因此可通过诱导miR159建立ABA体内平衡。本研究中miR159在杂合体中被逐渐诱导, IM至SPM期被显著抑制, SPM至SM期被抑制, FM期被显著诱导。杂交种郑单958雌穗发育中的miR159的表达水平逐渐提高, 可能通过影响其靶mRNA而降低ABA敏感性, 表明在玉米雌穗期可能发生ABA调控过程。
玉米不定小穗基因I ()是玉米miR172e的靶基因, 在SPM至SM期大量表达[11-12]。本研究中的miR172e表达与其他miR172家族成员有所不同, 特别是SPM至SM期间存在较低的拷贝数, 表明miRNA稳态是决定玉米雌穗发育的主要因素, 而且同一个基因家族的不同成员也可能发挥不同的功能。
除miR172外, miRNA家族的其他成员同样具有显著的差异表达水平(表6)。如miR164e与miR164家族的其他成员相比, 其表达量差异超过100倍, miR156k表达量差异超过60倍。同一家族差异表达的miRNA成员不仅具有不同前体, 而且成熟miRNA也很少具有差异序列, 例如zma-miR164e和zma-miR164a-d仅在最后2个(AG/CA)核苷酸处存在差异。通过比较相同miRNA家族不同成员的丰度, 发现有关特定miRNA在不同发育阶段中发挥的作用, 以此区分家族中各个成员的调节模式。
构建了miRNA通过其靶基因参与雌穗杂种优势形成的可能模式, 并推测miRNA可能在玉米雌穗发育阶段通过非加性表达参与雌穗杂种优势性状的建立, 雌穗发育早期阶段miRNA的普遍抑制及随后时期的逐渐解除抑制可能是雌穗杂种优势形成的原因。
表6 测序获得的表达量数据
(续表6)
(续表6)
(续表6)
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Investigation of Maize miRNA Involved in Developing-ear Heterosis
WANG Qi-Yue1, MENG Shu-Jun1, ZHANG Ke2, ZHANG Zhan-Hui1, TANG Ji-Hua1, and DING Dong1,*
1College of Agronomy, Henan Agricultural University / Key Laboratory of Wheat and Maize Crops Science, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China
Heterosis has been utilized widely in maize breeding; it plays an important role in increasing yield, improving quality and enhancing stresses resistance. However, the molecular mechanism of heterosis is far from clear. MicroRNAs (miRNAs) act as key regulating factors of gene expression in post-transcriptional level. To investigate whether miRNA-dependent gene regulation is responsible for heterosis during maize ear development, we performed an illumine miRNA deep-sequencing on the most widely-planted elite hybrid Zhengdan 958 and its parental inbred lines (Chang 7-2 and Zheng 58) in China. The ear samples at the developmental stages of inflorescence meristem (IM) producing spikelet pair meristems (SPM), resulting in spikelet meristems (SMs), and floral meristems (FM) were collected for RNA library construction. As a result, 81 conserved miRNAs belonging to 16 miRNA families were identified which were non-additively expressed. At the three stages, 80.30%, 56.06%, and 48.10% of these non-additively expressed miRNAs were repressed ever dominantly or over-dominantly. A total of 82 target transcripts from 42 genes of conserved miRNAs among Zhengdan 958 and its parents were detected via whole genome degradome sequencing. Additionally, eight novel maize miRNAs belonging to seven miRNA families were identified using stringent criteria. Global repression of miRNAs in hybrid ears at the early stage might lead to the up-regulated expressing of their target genes. Moreover, the in-step de-repression of given miRNA family members may be the reason of enhanced repression of their target genes. These results revealed, at least in part, the involvement of maize miRNAs in hybrids leads to higher ear developing vigor compared with its parental lines.
ear development; heterosis; miRNA; degradome;L.
2017-09-29;
2018-03-26;
2018-04-18.
10.3724/SP.J.1006.2018.00796
丁冬, E-mail: dingdong0216@163.com
E-mail: 13633857567@163.com
本研究由国家自然科学基金项目(31370033)和国家高技术研究发展计划项目(2012AA10A305)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31370033) and the National High Technology Research and Development Program of China (2012AA10A305).
URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180416.0843.006.html