HPLC切换波长法同时测定健脾止泻宁颗粒中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量Δ

黄传俊，杨 莉，梅 勇#，罗 磊，吕姗珊，曾博程，龙 涛，王 凤，左 娟，袁开超，唐 攀，朱 锋，陈波，谯志文（1.湖北省中医院药事部，武汉40061；2.湖北省中医药研究院，武汉40074；.重庆思科药物研究所有限公司，重庆 401520）

健脾止泻宁颗粒系国家中药保护品种，由党参、莲子、白扁豆、黄连、黄芩、金银花、山楂、车前子（盐炙）、建曲、干姜等10味中药材组合而成[1]，具有清热除湿、抗炎镇痛[2]、促消化、促吸收、止泻[3-4]、增强免疫功能[5]和改善肠道微生态环境[6]等功效，临床上用于治疗小儿脾虚湿热型急性腹泻[7]、小儿迁延性腹泻病（脾虚湿热证）[8]、溃疡性结肠炎[9]。该药现行国家药品标准[10]含量测定项中仅以薄层色谱法（TLC）扫描测定黄连有效成分盐酸小檗碱的含量。方中黄连有效成分盐酸小檗碱对细菌有明显的抑制作用[11]；黄芩有效成分为黄酮类化合物，其中黄芩苷含量较高，具有多种生物活性，且有抑菌、抑制病毒的作用[12]。本研究以高效液相色谱（HPLC）切换波长法同时测定健脾止泻宁颗粒中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量，以期为提高该制剂的质量标准提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-2030型HPLC仪（包括在线脱气机、二元高压泵、自动进样器、二级管阵列检测器、LabSolutions色谱工作站）、UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；CP225D型电子分析天平、BS124S型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

健脾止泻宁颗粒（重庆希尔安药业有限公司，批号：170101、170501、170901，规格：3 g/袋）；盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201212，纯度：86.7%）、黄芩苷对照品（批号：110715-201318，纯度：93.3%）均购于中国食品药品检定研究院；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.45%磷酸溶液-三乙胺（50∶49∶1，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：265 nm（盐酸小檗碱）、280 nm（黄芩苷）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱、黄芩苷对照品各适量，精密称定，加DMF 5 mL，超声（功率：200 W，频率：40 kHz，下同）处理5 min，加甲醇稀释制成盐酸小檗碱、黄芩苷质量浓度均约为300 μg/mL的混合对照品溶液。2.2.2 供试品溶液 取样品0.6 g，研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加DMF 5 mL，超声处理5 min，放冷，加甲醇稀释定容至50 mL，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过后，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按健脾止泻宁颗粒处方和工艺分别制备缺黄连、缺黄芩的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果，在265 nm波长处，盐酸小檗碱色谱峰与其他色谱峰呈基线分离，理论板数以盐酸小檗碱峰计大于4 000，分离度大于3.0；在280 nm波长处，黄芩苷色谱峰与其他色谱峰呈基线分离，理论板数以黄芩苷峰计大于6 000，分离度大于2.0。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 专属性试验

取上述混合对照品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果，在与盐酸小檗碱或黄芩苷对照品保留时间相同处，阴性对照无色谱峰干扰，表明专属性良好。

2.5 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以盐酸小檗碱和黄芩苷进样量（x，ng）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得盐酸小檗碱和黄芩苷回归方程分别为y＝52 647x+930.8（r＝0.999 7）、y＝59 742x-154.9（r＝0.999 9）。结果表明，盐酸小檗碱和黄芩苷检测进样量线性范围分别为60.3～312.8、81.5～368.9 ng。

2.6 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下色谱条件进样测定。当信噪比为10∶1时，得盐酸小檗碱和黄芩苷定量限分别为0.666 8、0.774 0 ng；当信噪比为3∶1时，得盐酸小檗碱和黄芩苷检测限分别为0.222 6、0.258 0 ng。

2.7 中间精密度试验

由不同分析人员于不同时间，精密称取样品（批号：170501），共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件连续进样，记录峰面积并计算含量，结果见表1。

表1 中间精密度试验结果（n＝12）Tab 1 Results of intermediate precision tests（n＝12）

2.8 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：170501）适量，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24、48 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，盐酸小檗碱和黄芩苷峰面积的RSD分别为0.90%、0.70%（n＝8），表明供试品溶液在室温下放置12 h内基本稳定。

2.9 重复性试验

精密称取样品（批号：170501）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，盐酸小檗碱和黄芩苷含量平均值分别为5.73、5.36 mg/g，RSD分别为0.25%、0.60%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知含量样品（批号：170501）适量，共6份，分别加入对照品溶液（盐酸小檗碱：1.756 mg/mL，黄芩苷：1.624 mg/mL）各1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.11 耐用性试验

2.11.1 改变色谱柱 取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件以不同色谱柱[Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5µm）、Wondasil C18（250 mm×4.6 mm，5µm）、Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5µm）]进样测定，记录峰面积并计算含量，详见表3。结果，盐酸小檗碱和黄芩苷含量平均值分别为5.74、5.32 mg/g，RSD分别为1.12%、1.15%，表明本色谱条件在一定色谱柱变动情况下耐用。

表3 耐用性试验结果Tab 3 Results of durability tests

2.11.2 改变流动相 取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件以不同流动相[甲醇-0.45%磷酸溶液-三乙胺比例（V/V/V）分别为50∶49∶1、48∶52∶1、52∶48∶1]进样测定，记录峰面积并计算含量，详见表3。结果，盐酸小檗碱和黄芩苷含量平均值分别为5.75、5.35 mg/g，RSD均为0.75%，表明本色谱条件在一定流动相变动情况下耐用。

2.11.3 改变流速 取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件以不同流速（1.0、0.9、1.1 mL/min）进样测定，记录峰面积并计算含量，详见表3。结果，盐酸小檗碱和黄芩苷含量平均值分别为5.74、5.36 mg/g，RSD分别为0.44%、0.84%，表明本色谱条件在一定流速变动情况下耐用。

2.11.4 改变柱温 取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件以不同柱温（30、25、35℃）进样测定，记录峰面积并计算含量，详见表3。结果，盐酸小檗碱和黄芩苷含量平均值分别为5.72、5.34 mg/g，RSD分别为0.27%、0.47%，表明本色谱条件在一定柱温变动情况下耐用。

2.12 样品含量测定

取3批样品内容物各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 4 Content determination results of samples（n＝3，mg/g）

3 讨论

预试验中，笔者以盐酸小檗碱和黄芩苷对照品溶液在190～400 nm波长范围内进行扫描，结果显示盐酸小檗碱在265 nm波长处有最大吸收，黄芩苷在280 nm波长处有最大吸收。因此，确定盐酸小檗碱测定波长为265 nm、黄芩苷的测定波长为280 nm。

在样品提取方法上，笔者分别考察了盐酸-甲醇溶液（1∶100，V/V）超声处理20 min、70%乙醇溶液超声处理30 min以及加DMF超声处理5 min。结果，第一种提取方法提取黄芩苷含量较低，第二种方法提取盐酸小檗碱含量较低，而采用DMF提取超声处理对2种成分的提取效果均较好。在色谱条件的选择中，笔者分别考察了甲醇-水、甲醇-磷酸二氢钾溶液、甲醇-磷酸溶液-三乙胺等流动相系统，结果采用甲醇-0.4%磷酸溶液-三乙胺（50∶49∶1，V/V/V）为流动相时，所得目标成分与相邻峰之间的分离度好、峰形尖锐、对称性好，理论板数均大于4 000，能满足HPLC法的相关要求。

综上所述，本方法操作简便，精密度、准确度、稳定性、重复性、耐用性均较好，可用于健脾止泻宁颗粒中盐酸小檗碱和黄芩苷含量的同时测定。

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