比色法测定酱油中氨基酸态氮的探讨

章银珠 ，杨广，李冬梅，励丹，翁婉丹

(宁波市食品检验检测研究院，浙江 宁波 315000)

酿造酱油酱香味浓郁、味道鲜美、色泽诱人，是生活中必不可少的调味品。酱油独特的美味主要是鲜味，Hanifah Nuryani Lioe等指出，酱油的鲜味主要是一些分子量小于500 Da的物质，而游离氨基酸是在钠盐存在下对味觉有重要作用的低分子化合物。另外还有一些肽类物质，尽管其含量极低，但对鲜味却有很大的贡献作用[1,2]。可见，酱油氨基酸态氮的含量对酱油的营养和质量有着至关重要的影响。通常，氨基酸态氮含量越高，酱油品质就越高，鲜味也会越浓。而酱油的国家标准也是根据氨基酸态氮的含量来分级，特级酱油的氨基酸态氮需要大于0.80 g/dL，而最低等级三级的酱油，其氨基酸态氮含量也要不低于0.40 g/dL。因工艺的改进，市售的特级酱油氨基酸态氮含量可以达到1.20 g/dL以上。

传统的氨基酸测定的方法原理是依据其氨基酸两性分子结构，即呈碱性的氨基端或者呈酸性的羧基端。酱油的国家标准GB 18186-2000《酱油》规定，氨基酸态氮含量的检测方法为甲醛值法[3]。该法的原理为定量羧基，即加入甲醛以固定氨基端的碱性，使羧基端显示出酸性，再用氢氧化钠标准滴定溶液定量。该法分析成本较低，测定结果也准确，因此被广泛应用。但是它的缺点是滴定速度较慢，检测过程中仪器设备和试剂等的影响因素也较多。新实行的食品安全国家标准GB 5009.235-2016规定酱油氨基酸态氮的检测方法分别为酸度计法(甲醛值法)和比色法[4]。比色法的原理为定量氨基端，用硫酸铵为标准物质，用分光光度法显色定量。该法操作简便、灵敏、快速、取样量少，适合批量处理，但是该法目前应用不普遍，尤其在企业中甚少使用。本文探讨了比色法应用过程中的注意事项，同时对市售的多种不同等级的酱油的氨基酸态氮含量进行多次测定，结果与酸度计法结果相一致[5-8]。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

紫外可见分光光度计：普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试剂

乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 4.8)、甲醛溶液(36%～38%)、显色剂： 37%甲醛15 mL与乙酰丙酮7.8 mL混合，加水稀释定容至100 mL，剧烈振摇混匀；氨氮标准储备液(1.0 mg/mL)：称取0.4720 g 在105 ℃干燥2 h的硫酸铵，加水稀释至100 mL，混匀；氨氮标准使用液(0.1 mg/mL)：移取10 mL氨氮标准储备液于100 mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。所有试剂均为国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制作

分别移取氨氮标准使用溶液(0.1 mg/mL)0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL比色管中，分别加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液4 mL、显色剂4 mL，用水稀释至刻度，混匀。然后置沸水浴中加热15 min后取出，冷却至室温。最后以零管为参比调零，用10 mm比色皿，于400 nm波长处测量标准曲线溶液的吸光值。以吸光度为纵坐标，氨氮含量为横坐标，绘制标准的曲线，并计算线性回归方程[9，10]。

1.3.2 氨基酸态氮含量的测定

称取试样1.00 g(m)于100 mL(V2)容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。吸取该稀释液0.50 mL(V1)于10 mL比色管中，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液4 mL及显色剂4 mL，用水稀释至刻度，混匀。然后置沸水浴中加热15 min后取出，冷却至室温。而后以零管为参比，用10 mm比色皿，于400 nm波长处测量试样溶液的吸光值。同时进行样品空白试验。试样吸光度扣除样品空白吸光度后，代入线性回归方程，计算试样中氨基酸态氮的含量(m1)。

氨基酸态氮含量(g/100 g)=m1m×1000×1000×V1V2×100。

2 结果

2.1 显色剂的放置时间的影响

分别用现配、放置1天、放置2天、放置3天、放置4天、放置5天的显色剂对标准曲线溶液及同一个样品进行显色，记录其吸光值，并根据所绘制标准曲线来测定该样品中氨基酸态氮的含量并测定其加标回收率，测定结果见表1。

表1 放置不同时间的显色剂对标准曲线单点的测定结果Table 1 Results of the single point of the standard curvedetermined by the color reagent of different time

由表1可知，随着显色剂放置时间的延长，标准曲线线性明显下降(从0.0113降到0.0082)，测定结果也偏低，导致回收率偏高。而放置3天以后的回收率已经不符合实验室要求。

2.2 样品空白的影响

酱油本身具有较深的酱色，市售的酱油通常分为生抽和老抽，生抽主要用来上浅色或者佐餐，而老抽颜色较深且浓稠，主要用来上色。本试验分别抽取生抽和老抽各3种进行样品空白处理：吸取试样稀释液0.5 mL，加入缓冲溶液4 mL，不加显色剂，直接用水稀释定容至10 mL，于400 nm处测定吸光值，样品空白吸光值见表2。

表2 样品空白吸光度Table 2 Sample blank absorbance

由表2可知，不同种酱油空白值不同，生抽较小，可忽略，而老抽的吸光值较大，测定中必须扣除样品空白。

2.3 冷却方式的影响

试验过程中，加显色剂后需在沸水浴中显色，若令其自然冷却，结果会出现浑浊现象，将其过膜后比色试验吸光值偏低(见表3)，在样品中表现尤为明显，最大的吸光值差为0.132。而沸水浴15 min后若迅速将其冷却，则未出现浑浊，冷却后色泽恒定，且未再次出现浑浊。究其原因是自然冷却使其加热时间相对延长，因此沸水浴后需迅速冷却。

表3 冷却方式对吸光度的影响Table 3 Influence of cooling methods on absorbance

2.4 标准曲线的绘制

绘制的标准曲线及回归方程，结果见表4。

表4 标准曲线Table 4 Standard curve

2.5 回收率试验

对比色法进行回收率试验，结果见表5。

表5 回收率试验Table 5 Recovery test

2.6 比色法测定酱油氨基酸态氮

对市售的5种酱油的氨基酸态氮含量进行测定，并进行平行试验，结果见表6[11]。试验数据精密度较好，绝对标准偏差符合要求(<10%)。

表6 比色法测定酱油氨基酸态氮的结果Table 6 Determination of amino acid nitrogen in soy sauce by colorimetry

注：线性回归方程为y=0.0113x，R2=0.9993。

2.7 比色法与酸度计法测定结果比较

另取10个品种的酱油样品，分别用酸度计法和比色法测定其氨基酸态氮的含量，结果见表7。可见，2种方法无显著性差异(P>0.05)。

表7 两种方法测定氨基酸态氮的结果比较Table 7 Comparison of results of two methods for the determination of amino acid nitrogen

3 讨论

显色剂为显色反应关键试剂。配制显色剂时，甲醛溶液不应有沉淀且溶液不分层，与乙酰丙酮混合时必须剧烈振摇，充分混匀。该混合试剂不能放在冰箱内保存，应在室温下放置。因甲醛放置时间过长会形成聚合沉淀析出晶体造成失效，在较冷时久贮易浑浊，在低温时则形成三聚甲醛沉淀；而乙酰丙酮受光作用会转化成褐色液体，并且生成树脂。而表1也表明，放置时间越长，显色效果下降，放置3天后下降较前3天明显，且与滴定法相比，样品测定结果偏低，回收率也变差，且放置3天后的回收率已不能满足实验室的检测要求(要求95%～105%)，故显色剂需存放于棕色试剂瓶中，且不宜放置过长时间使用，室温下放置3日内使用。

酱油有较深的酱色，且不同的酱油色泽深浅不一，酱油稀释液本身带黄色本底，而400 nm处为黄色吸收波段，本底对显色结果有影响。通过考察不同的老抽和生抽酱油的样品空白值(见表2)不同酱油的样品空白值差异较大，生抽的本底相对较小，而老抽因其色泽太深，且相对粘稠，空白吸光值较大，因此，需进行样品空白试验。

沸水浴显色后需迅速冷却以防止溶液出现浑浊。

4 结论

综上分析，用比色法测定酱油中氨基酸态氮含量时，需注意显色剂的使用、扣除样品颜色本底、沸水浴后迅速冷却比色。与酸度计法比较，两种方法结果无显著性差异(P>0.05)，因此两种方法虽然测定原理不同，但只要保证方法数据准确，两种方法的结果是一致的，可以根据实验仪器设备条件和样品批量自由选择方法。

参考文献：

[1]Alam Shah Syifaa,Selamat Jinap,Maimunah Sanny,et al.Chemical profiling of different types of soy sauce and the relationship with its sensory attributes[J].Food Quality,2016(39):714-725.

[2]Hanifah Nuryani Lioe,Jinap Selamat,Masaaki Yasuda.Soy sauce and its umami taste: a link from the past to current situation[J].Journal of Food Science,2010(75):71-76.

[3]GB 18186-2000，酿造酱油[S].

[4]GB 5009.235-2016，食品中氨基酸态氮的测定[S].

[5]章银珠,赵春玲,沙晨.影响酱油中氨基酸态氮含量测定空白值的因素[J].食品研究与开发,2014,35(1):82-83.

[6]胡亚云,崔璐,于修.光程对酱油总酸和氨基酸态氮定量分析模型的影响研究[J].中国调味品,2016,41(7):11-14.

[7]Suzanne Nielsen.Food Analysis Laboratory Manual (second edition)[M].Springer:New York ,2006.

[8]张文德,尹璐,马志东,等.用Hantzsch反应光度法测定食品中蛋白质的研究[J].卫生研究,1997,26(5):340-342.

[9]Shin-Yi Lin,Yu-Chang Lo,Yu-Kai Chen,et al.Nonvolatile taste components and functional compounds of commercial soy sauce products[J].Food Processing and Preservation,2015,39(6):2680-2686.

[10]尤生萍,肖华志,孙亚培,等.市售酱油常用理化指标的检测分析[J].中国调味品,2011,36(4):98-101.

[11]郭峰,王斌,陆洋.酱油中总酸和氨基酸态氮成分的快速检测及研究[J].食品科学,2006,27(12):699-703.