HPLC法同时测定余甘子中5种成分的含量及主成分、聚类分析Δ

李琦，裴河欢，李静，罗亚虹（1.桂林市食品药品检验所，广西桂林541012；2.钦州市中医医院科研科，广西钦州 535000；3.钦州市中医药研究所，广西钦州 535000）

余甘子为大戟科植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.）的干燥成熟果实，异名油甘子、牛甘子、喉甘子、鱼木果等，是一味传统民族药，主要分布于福建、广东、广西等地。其以果实入药，主治血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛等症[1-2]。现代药理学研究表明，余甘子中富含的多元酚类化合物具有抗氧化作用，能减轻自由基对机体的损伤，缓解疲劳[3-4]。文献[5-7]报道了同时测定余甘子中3～4种多元酚类化合物的含量。为提高余甘子质量控制标准，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定广西余甘子中5种多元酚类化合物的含量，并对广西12个采集地余甘子中所含5种多元酚类化合物的含量进行主成分分析和聚类分析[8-14]，将复杂的多指标转化为少数代表性的综合指标，从而识别药材质量的优劣和产地的规律性，为余甘子药材质量控制和综合评价提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1260 InfinityⅡHPLC仪，包括G7115A二极管阵列宽波长范围检测器、G7129A自动进样器、G7111B四元梯度泵（美国Agilent公司）；XS205DU电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；101-1-BS-Ⅱ鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；DTA-42超声波清洗机[鼎泰（湖北）生化科技设备制造有限公司]；Simplicity超纯水系统（德国Merck Millipore公司）。

1.2 试剂

没食子酸对照品（批号：110831-201605，纯度：90.8%）、柯里拉京对照品（批号：111623-200301，纯度：100%）、鞣花酸对照品（批号：111959-201602，纯度：89.3%）均购自中国食品药品检定研究院；没食子儿茶素对照品（批号：PRF7081801，纯度：98%）、诃子联苯酸对照品（批号：PRF8032222，纯度：92%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司；乙腈、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

药材来源见表1。所有样品经挑选，为饱满、质实、无虫霉者。经广西中医药大学药学院刘寿养副教授鉴定均为大戟科植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.）的新鲜成熟果实。将挑选后的样品用超纯水洗净，干燥，去核，粉碎制成直径为0.5～0.8 cm的粗颗粒，充分混合均匀，再按四分法取样，每份约200 g，备用。

生品：取余甘子粗颗粒，粉碎，过四号筛，混合均匀，备用。

表1 药材来源Tab 1 Sources of P.emblica

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，4%A；10～11 min，4%→6%A；11～25 min，6%→13%A；25～35 min，13%→14%A；35～36 min，14%→15%A；36～50 min，15%→17%A；50～60 min，17%→4%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液 ①精密称取没食子酸对照品10.98 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为199.4 μg/mL的对照品贮备液A。精密吸取对照品贮备液A 5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为39.88 μg/mL的对照品贮备液B。②精密称取没食子儿茶素对照品10.19 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为19.97 μg/mL的对照品贮备液C。精密吸取对照品贮备液C 5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为1.997 μg/mL的对照品贮备液D。③精密称取柯里拉京对照品15.11mg，置于100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为151.1 μg/mL的对照品贮备液E。④精密称取诃子联苯酸对照品20.04 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为368.7 μg/mL的对照品贮备液F。⑤精密称取鞣花酸对照品16.55 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为295.6 μg/mL的对照品贮备液G。精密吸取对照品贮备液G 5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为29.56 μg/mL的对照品贮备液H。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密吸取“2.2.1”项下对照品贮备液B、D、E、F、H各1 mL，置于同一10 mL棕色量瓶中，甲醇定容，制成含没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸质量浓度分别为3.988、0.199 7、15.11、36.87、2.956 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 取“1.3”项下生品约0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声（功率：900 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

取“2.2.2”项下混合对照品溶液和“2.2.3”项下供试品溶液（编号S5）适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，在该色谱条件下，各待测成分间与杂质峰间均能达到基线分离，分离度＞1.5，其他成分对待测成分的测定无干扰，理论板数以没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸峰计均＞3 000，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下对照品贮备液A 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，对照品贮备液C 0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mL，对照品贮备液E 1.5、3.0、6.0、12.0、15.0 mL，对照品贮备液F 2.0、4.0、8.0、10.0、12.0 mL，对照品贮备液G 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分别置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。线性关系考察结果见表2。

表2 线性关系考察结果Tab 2 Results of linear range investigation

2.5 检测限与定量限考察

取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为3∶1时，得检测限；当信噪比为10∶1时，得定量限。结果，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸和鞣花酸的检测限分别为0.025 6、0.027 1、0.052 9、0.186 7、0.133 1 μg/mL，定量限分别为0.085 1、0.089 3、0.170 6、0.615 2、0.441 9 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，计算日内精密度；连续进样测定3 d，计算日间精密度。结果，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸峰面积的日内精密度RSD分别为0.21%、0.88%、0.14%、0.20%、0.64%（n＝6），日间精密度RSD分别为0.26%、1.42%、0.25%、0.24%、0.67%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.3”项下供试品溶液（编号S5）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、10、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸峰面积的RSD分别为0.45%、0.63%、0.27%、0.57%、0.60%（n＝7），表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取编号S5的生品约0.1 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并扣除生品（编号S5）含水量后，再计算含量。结果，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸含量平均值分别为2.314 4、0.109 1、6.138 6、12.394 5、1.938 1 mg/g，RSD 分别为 0.76%、1.38%、0.55%、0.84%、1.02%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的“1.3”项下生品（编号S5）约0.05 g，共6份，分别加入一定体积的“2.2.1”项下对照品贮备液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并扣除生品（编号S5）含水量计算，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3Results of recovery tests（n＝6）

2.10 样品含量测定

各取12批生品约0.1 g，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并扣除12批生品中含水量后，再计算样品含量。结果显示，12批生品中，诃子联苯酸含量差异最小，其余4种成分含量差异较大，其中没食子酸含量高低相差近5倍，表明广西不同产地余甘子药材质量存在一定差异，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

2.11 主成分分析

主成分分析具有降维思想，可以把多个指标转化为少数几个综合指标，使这些少数的综合指标又能尽量多地反映原来较多指标所反映的信息。通过SPSS 25.0软件对12批样品含量测定结果进行主成分分析。结果，特征值＞0.95的前3个主成分累积方差贡献率为85.753%，能基本说明样本大部分信息，见表5、表6。主成分1贡献度最显著，其中没食子酸、没食子儿茶素、鞣花酸载荷较高，说明主成分1主要反映了这3种成分指标的信息；主成分2主要体现诃子联苯酸的信息；对主成分3贡献最大的是柯里拉京。根据各主成分得分进行综合评价，其综合得分（F）＝0.513 1×F1+0.265 4×F2+0.221 5×F3，结果发现所收集的样品中编号S9的综合得分（F）最高，药材质量较好，结果见表7。

表5 主成分特征值和方差贡献率Tab 5 Characteristic value and variance contribution rate of principal component

2.12 聚类分析

为了考察广西余甘子中5种成分的含量差异与产地之间的相互关系，通过SPSS 25.0软件和欧式距离系数对12批样品进行聚类分析。当15＜阈值＜25时，可分为两类，第Ⅰ类：S11；第Ⅱ类：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S12。结合主成分得分排序，可知S11质量稍差。当5＜阈值＜9时，可将第Ⅱ类细分为四类，第1类：S4、S9、S1，在表7评价排序中分别为第4、1、3位；第2类：S2、S10，在表7评价排序中分别为第5、2位，第1类和第2类又可聚成一类，说明这两类质量较好，可见排第1、2位广西玉林市容县的质量最好。第3、4类中S12、S3、S8、S5、S6、S7在表7评价排序中为第6～12位（第9位除外），说明这两类质量稍差，结果见图2。

表6 主成分矩阵Tab 6 Principal component matrix

表7 主成分得分综合评价结果Tab 7 Results of comprehensive principal component evaluation

图2 聚类分析树状图Fig 2 Cluster analysis tree diagram

3 讨论

笔者在预试验中考察了用25%甲醇、50%甲醇、甲醇对余甘子的超声提取率，结果其提取率分别为11%、19%、19%，结果显示50%甲醇和甲醇的超声提取率较高。因鞣花酸具水难溶性[15]，在低浓度甲醇中溶解性能较差，而高浓度甲醇提取出的杂质成分较多，检测易造成干扰，故采用50%甲醇作为提取溶剂。预试验二极管阵列检测器图谱分析结果显示，没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸和鞣花酸分别在270、220、280、254 nm波长处有最大吸收。在220 nm波长处基线平稳，色谱峰相互之间分离效果较好，且各峰形较好，故选择检测波长为220 nm。当有机相选用甲醇时，流动相梯度洗脱过程中基线波动较大，而当乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时，基线平稳，各色谱峰分离效果也较好，故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。

在化学结构上，多元酚类化合物是氢或电子供体，因具有酚类游离基中间体的共振非定域作用和没有适合分子氧进攻的位置，所以比较稳定，不会引起新的游离基或者因链反应而被迅速氧化[16]，因此具有抗氧化作用。另据文献[17]报道，多元酚类化合物在余甘子中含量高达12.9%，而没食子酸是余甘子中多元酚类化合物的主要成分。这与表6中没食子酸、没食子儿茶素在主成分1中载荷较高相一致。由表4可知，没食子酸含量在广西不同产地之间差异较大，梧州市藤县和平镇的没食子酸含量为9.478 7 mg/g，而钦州市灵山县平南镇的没食子酸含量为2.096 8 mg/g，相差近5倍，说明产地不同，化学成分的含量存在较大差异，为确保余甘子药材质量，应相对固定产地采收。经主成分分析，表7中F值越大说明余甘子中成分综合含量越高，质量越好，由此可知S9质量较好。经聚类分析，广西不同产地余甘子质量有差异。基本按地域性聚成2类，其中1类又可细分为四小类：玉林市容县、梧州市藤县等地区分别聚成质量较好的两小类，崇左市龙州县、钦州市灵山县及百色市田林县等地区分别聚成质量稍差的另两小类，该分类符合地域分布特征。但梧州市藤县个别地区与崇左市龙州县地区聚成一类，这也说明除不同分布区地理和气候因子影响外[18]，造成同一分布区质量差异还可能与当地的种植栽培条件等因素有关。

综上，本研究建立的方法操作简便、结果准确可靠，可用于余甘子中没食子酸、没食子儿茶素、柯里拉京、诃子联苯酸、鞣花酸含量的同时测定。另外，在同时测定余甘子中5种成分含量的基础上，结合主成分分析和聚类分析，提示广西不同产地余甘子质量有差异。

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