燕麦花药组织培养影响因子研究进展

田娟 张曼 董玉迪 孙墨可 王春龙 沙莉 任长忠

摘要 燕麦花药组织培养受各种因子的影响，从基因型、供体植株生长条件、花药的选择、预处理、培养基、培养条件几个方面对国内外燕麦花药组织培养研究进展进行综述，以期为燕麦花药组织培养提供参考。

关键词 燕麦;花药组织培养;影响因子

中图分类号 S188+.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）35-0011-03

花药组织培养是用植物组织培养技术把发育到一定阶段的花药通过无菌操作技术接种在人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行有丝分裂，形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织——愈伤组织，或分化成胚状体，随后使愈伤组织分化成完整的植株。花药培养育种具有缩短育种年限、快速稳定变异性、提高选择效率等优点[1]。在小麦[2-3]、水稻[4-5]、烤烟[6]、辣椒[7-8]等的育种实践中，花培技术已显示了其应用价值。在国内，关于燕麦花药组织培养的报道很少，只有孙敬三等[9]用裸燕麦花药建立了分散好、生长快的单倍体悬浮细胞培养物，现在报道的关于燕麦的组织培养大多是子房[10]、颖片[11]、幼叶[12]、顶端分生组织[13-14]、幼穗[15]、幼胚[16-17]、成熟胚[18-20]、种子和根[21]等。就国外而言，1980年Chung[22]报道了燕麦花药培养中有愈伤组织的发生;第1个从燕麦花药培养中获得植株的是Rines[23]，他报道了一个燕麦品种CV培养65 000余个花药，其中2 627个产生愈伤组织，获得一个单倍体和二倍体植株;Polsoni[24]1991年在燕麦中获得一些愈伤组织，但没有获得植株;Sun等[25]获得12株绿色植株和一个白化苗植株。以上研究表明用燕麦作花药组织培养是可行的，但是成功率比较低，燕麦属植物的花药组织培养比较难。之所以成功率低、比较困难是因为影响愈伤组织发生的因素很多，该研究就国内外燕麦花药组织培养研究进展，从基因型、供体植株生长条件、花药的选择、预处理、培养基、培养条件等方面进行综述，以期为燕麦花药组织培养提供参考。

1 基因型

供体植株的基因型是影响花药和花粉培养的关键因素， 不同基因型的植株对培养的反应不同，表现为是否可诱导愈伤组织的生成，生成愈伤组织的多少和大小，以及绿苗分化、白化苗的产生等。芬兰农业研究中心的Kiviharju等[26]对44个燕麦品种（Avena sativa L.）、6个裸燕麦（A sativa L.）、15个野生燕麦（Avena sterilis L.）、5个种内杂交（A.sativa.×A.sativa.）和2个种间杂交（A.sativa.×A.sterilis.）進行研究，结果表明：野生燕麦的出愈率优于裸燕麦且只有野生燕麦获得再生植株，反应了燕麦花药组织培养受基因型影响很大。2005年杨才等[27]研究发现燕麦品种间出愈率差异在 0.0%～48.5%，且 F1代出愈率与双亲出愈率的高低相关性强。Kiviharju等[28]对14个燕麦品种进行花药组织培养，结果只有6个基因型获得再生植株。Noga等[29]对21个不同燕麦杂交组合进行研究，结果表明愈伤组织大小与基因型显著相关，单倍体胚胎的萌发能力在燕麦基因型之间有显著差异。

2 供体植株生长条件

即使基因型相符，供体植物的生理状态对花药组织培养也有影响，这取决于生长条件。有报道指出，一些植物在正常生长季节生产的田间材料要比温室培养的材料好[30]、健康、有活力的供体植株对于成功的花药/小孢子培养是必不可少的[31-32]。有时只有在控温、一定光周期和光强的环境条件下，花药才会有反应[33]。Kiviharju等[34]发现，同一燕麦品种（Aslack）在相同培养基、培养条件下的绿苗率不同，最可能的原因是供体植株生长条件不同引起的，供体植株培养时的温度、水分等都相同，唯一不同的是每天有数小时的自然光照射，在61°S随着季节的变化，自然光发生变化。

3 花粉（花药内的小孢子）的发育时期

小孢子发育阶段是诱导花粉胚发育的关键阶段。在小孢子发生的某些阶段，小孢子并没有完全参与配子发育，可以诱导胚胎发生[35];最佳敏感的发育阶段因物种而不同，在对植物进行广泛的研究中，第1次有丝分裂是雄性激素诱导的最佳时期[36]。王子霞等[11]选取花粉处于单核中晚期燕麦穗子的颖片进行离体培养，获得再生植株。Sidhu等[37]选取处于单核中期的燕麦幼穗进行小孢子离体培养，首次从离体燕麦小孢子中获得再生绿色植株。Ferrie[33]以燕麦2000QION43品系为材料，选取单核晚期至双核早期的幼穗获得愈伤组织和再生植株，通过以上研究发现，燕麦诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期是单核中后期至双核早期。

4 预处理

4.1 冷处理

1998年Kiviharju等[38]对燕麦Stout在4 ℃条件下处理0、7、14、21、28 d，结果处理7 d的愈伤组织最多，达到6.3%，表明7 d冷处理对Stout 的出愈水平略有提高;Sidhu等[37]对燕麦小孢子进行6～9周的4 ℃冷处理，获得2棵绿苗和15棵白化苗，研究发现，冷处理时间与多细胞结构产生的数量呈正相关，但长期的冷处理可能导致白化苗频率升高。Ferrie等[33]研究表明，使用0.3 mol/L甘露醇预处理收集的分蘖幼穗，在4 ℃下保持7 d，可产生比用水处理的分蘖获得更多的1～2 mm 胚胎，尽管用2种方法处理后愈伤组织发育的数量没有显著差异，但是甘露醇处理比水处理产生的绿苗增多，且白化苗病株减少。

4.2 热处理

Kiviharju等[38]在32 ℃条件下对分离出的花药处理5 d，裸燕麦WW18019（A sativa L.）和野生燕麦（Avena sterilis L.）CAV264815出愈率比较好。以后一些相关研究人员都继续做相关处理[34，39]。

5 培养基

燕麦花药培养效率的提高， 在很大程度上依赖于培养基成分、 激素配比以及培养基pH不同来实现的，可以说培养基的改良一直处于主导地位。

5.1 基础培养基

花药组织培养使用的基本培养基有大量元素、微量元素、维生素、糖类和生长因素等。培养基的组成在胚胎发生中起着主要的作用。经过前人的多年研究，N 6、KFWC、MS、W 14、FHG、TM、NLN、190-2、B5 等都用于燕麦花药培养的基本培养基[29-40]。其中常用且效果比较好的诱导培养基有KFWC、W 14和190-2，再生培养基一般为MS和W14。Ferrie等[33]以燕麦2000QION43品系为材料，对W 14、FHG、TM、NLN、KFWC这 5种诱导培养基进行燕麦花药培养对比试验，结果表明相较于其他培养基，对于燕麦花药组织培养KFWC、W 14培养基表现效果比较好。对MS，W14和B5这3种再生培养基进行比较，W14绿苗率最高（88%），其次是MS（82%），最差是B5（73%），相比之下W14的白化苗率最低。

5.2 激素配比及附加成分

Kiviharju等[26]报道燕麦栽培种、野生种以及它们的杂交种的花药培养，研究 2，4-D 、 KT对植株再生能力的影响，结果表明生长激素抑制燕麦（Avena sativa L）愈伤的出现，而在裸燕麦（A.sativa L.）、野生燕麦（Avena sterilis L.）和杂交后代（A.sativa.×A.sterilis.）中加入1.0 mg/L 2，4-D的诱导培养基会促进愈伤组织的出现;Rines[16]在未授粉子房的培养中，认为2 ，4-D 和 KT 联合作用反而降低愈伤组织的诱导率;Kiviharju等[39]研究不同激素及附加成分对再生植株的影响，获得22株绿苗，其中13株存活（11株单倍体，2株双单倍体），37株白化苗，结果表明：诱导培养基中加入1.0 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L KT时出愈率最高，促进愈伤组织的分化。但是6-BA能够促进白化苗的产生。与蔗糖相比，麦芽糖作为碳源，WW18019和Stout的出愈率更高;Kiviharju等[34]以Lisbeth 和Aslack为材料，以W14为基本培养基，对比30多个添加不同激素配比和附加成分的组合，发现与仅含2，4-D和KT相比，添加 2，4-D、BAP、乙烯利、L半胱氨酸和肌醇能够提高植株的再生率;Noga等[29]比较不同培养基对胚胎再生能力的影响，设置了不同激素配比，其中大多数单倍体胚胎在1mg/L ZEA+0.5 mg/L NAA中能夠再生。以上研究证明不同燕麦品种在同一激素配比中诱导结果不同，同一燕麦品种在不同培养基上反应结果也不同，所以不同燕麦品种有其最适的培养体系。

5.3 培养基的pH

培养基的pH影响植物体细胞胚胎诱导和发育[41]。有报道指出，燕麦花药组织培养的pH为5.8或者6.0[34，39];Sidhu等[37]指出使用pH 8.0的培养基比pH 5.8的培养基诱导出更多的愈伤组织，但是高pH培养基不支持细胞的持续生长，促进愈伤组织的褐化。Ferrie等[33]认为培养基pH和愈伤组织的数量相关，较高的pH水平（7.0和7.5）产生的愈伤组织的数量和质量明显优于较低的pH水平（4.5、5.0、5.8）。

6 培养条件

6.1 培养温度

体外胚胎发生可受小孢子的分离后条件的影响。许多研究都集中在适当的培养温度及其持续时间，不同物种之间也存在差异。Polsoni[24]研究发现，在25～30 ℃下燕麦花药愈伤组织的诱导比较好，Kiviharju 等[34]发现诱导愈伤组织的温度可以达到30 ℃，30 ℃时出愈率最高，但是28 ℃是绿苗的最佳温度。Ferrie等[33]研究表明，在28 ℃下燕麦小孢子培养具有较高的再生率。

6.2 培养光照

Kiviharju等[34]指出，燕麦Lisbeth在诱导期，黑暗培养比弱光培养[16/8，40 μmol/（m2·s）]提高愈伤组织的出愈率和再生苗率，但燕麦Aslack在黑暗和弱光下培养没有统计学上的差异。表明基因型对光反应是有差异的。Ferrie等[33]指出在诱导期间的黑暗对绿色植物生产更有效。

6.3 培养密度

小孢子和花药的密度是培养中的一个重要因素，它影响愈伤组织的质量和数量。当用小孢子培养时，小孢子密度一般为1×106个/mL时能够获得的愈伤组织较多，质量最好[33，36];当用花药直接培养时，一般花药的密度是30个/皿（直径3.5 cm）[34，38-39]。

7 讨论及展望

燕麦花培品种与常规育种品种相比不仅缩短了育种年限，而且品质好，但在实际生产中采用花药单倍体育成的燕麦新品种很少，没能够充分发挥其优势。其原因是影响燕麦花药组织培养的因子很多，存在显著的基因型依赖性、出愈率差、绿苗分化率较低、褐化、白化、玻璃化现象严重等。同时单倍体加倍率不高和与常规育种技术结合程度不高，也是限制其发展的主要因素。因此，大范围收集、筛选具有优良花培特性的燕麦基因型材料是发展花药培养技术的关键所在;提高花培效率，优化培养流程和培养条件，加强技术和育种材料的交流能够推动花药培养技术的进一步发展;最后加强与诱变技术、远缘杂交、分子标记辅助选择、转基因等技术相结合，将会提升花药的培养效率。随着下一代测序技术、高通量筛选突变体等现代分子生物学技术的迅猛发展，燕麦双单倍体材料（DH）的创制就显得尤为重要。

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