二甲双胍对于代谢综合征SD大鼠前列腺增生的影响

徐从云，黄　涛，潘大庆，肖　峻

良性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia, BPH)是中老年男性常见疾病，有统计显示在50～60岁和80岁以上的老年男性中BPH发病率分别高达50%和90%[1]。BPH可以导致排尿困难、泌尿系感染、泌尿系结石，甚至梗阻性肾病、肾功能衰竭等并发症[2]。代谢综合征是一组复杂的代谢紊乱症候群[3]。研究[4-5]表明高脂高糖饮食所致的代谢综合征和胰岛素抵抗，与前列腺增生的发生发展密切相关。二甲双胍是一种胰岛素增敏剂，常用于治疗Ⅱ型糖尿病。该研究通过高脂高糖饲养SD大鼠诱发代谢综合征，通过用二甲双胍干预治疗，观察胰岛素增敏剂对高脂高糖饮食饲养的SD大鼠的胰岛素抵抗水平、前列腺增生程度所产生的影响，并探讨Ⅱ型5α还原酶(SRD5A2)的表达与大鼠前列腺增生发生发展的关系，进而寻找BPH防治的新思路。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组健康SPF级SD雄性大鼠20只，由安徽省立医院实验动物中心提供，购入时4周龄，每只约70 g，随机分为普通饲养组(5只)和高脂高糖饲养组(15只)，高脂高糖饲料在普通饲料的基础之上加入猪油10%、白砂糖7%、全脂奶粉10%、鸡蛋6%、土豆淀粉2%。高脂高糖饲养组再随机分为高脂高糖空白对照组(5只)、高脂高糖生理盐水组(5只)和高脂高糖二甲双胍组(5只)。

1.2药物干预购入后前3天均进行适应性饲养。高脂高糖空白对照组、高脂高糖生理盐水组和高脂高糖二甲双胍组分别予以高脂高糖饲养、高脂高糖饲养加生理盐水灌胃(10 ml/d)和高脂高糖饲养加二甲双胍灌胃[20 mg/(kg·d)]。

1.3获取参数40 d后实验结束，测体质量，取材前12 h禁食水，尾尖取血测空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，腹腔注射麻醉后(10%水合氯醛,按3 ml/kg的剂量)，打开腹腔，心脏采血测空腹血浆胰岛素(fasting plasma insulin, FINS)，解剖获得前列腺组织，剔除前列腺周围脂肪并在吸水纸上吸干，称重计算前列腺指数[前列腺指数=前列腺湿重(mg)/大鼠体质量(100 g)]，胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)是用于评价个体的胰岛素抵抗水平的指标。HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(μIU/L)/22.5[6]。

1.4主要仪器和试剂FBG测定使用罗氏血糖仪Accu-chek及配套试纸。FINS测定采用放免法，Western blot所使用全蛋白提取试剂盒购自南京凯基公司；PVDF膜购自美国Milipore公司；SRD5A2、β-actin特异性抗体购自美国abcam公司；伊红染色剂、免疫组织化学染色所使用SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。

1.5化学染色福尔马林液固定前列腺组织，脱水、浸蜡、石蜡包埋、4 μm切片，用苏木精-伊红染色观察拍照。石蜡包埋切片标本使用二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、抗原修复、封闭内源性过氧化物酶活性后，加一抗稀释液(博奥森公司SRD5A2抗体，1 ∶500稀释)4 ℃孵育过夜，加即用型二抗室温孵育1 h；DAB显色、苏木精复染；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片镜检拍照。

1.6Westernblot提取组织总蛋白后标准曲线法检测蛋白浓度；混合上样缓冲液后置于沸水中3 min，等量上样，SDS-PAGE凝胶电泳；半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜上；PVDF膜置于封闭液中1 h，漂洗后置于一抗稀释液(博奥森公司SRD5A2抗体，1 ∶500稀释)4 ℃过夜，漂洗后置于二抗液室温2 h，漂洗后ECL化学发光显影定影；Image J软件检测计算条带灰度值，以目的条带与β-actin条带灰度比值计算表达量。

2　结果

2.1代谢综合征模型和药物干预4组大鼠FBG水平差异均无统计学意义。高脂高糖空白对照组与普通饲养组相比FINS水平明显增高,结果差异有统计学意义(P<0.05)，高脂高糖二甲双胍组与高脂高糖生理盐水组相比FINS水平明显降低(P<0.05)。高脂高糖空白对照组与普通饲养组的HOMA-IR相比明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，证明代谢综合征模型建立成功。高脂高糖二甲双胍组和高脂高糖生理盐水组HOMA-IR相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明胰岛素增敏剂二甲双胍可以降低高脂高糖饲养所诱发的胰岛素抵抗和代谢综合征症状。见表1。

2.2称重结果高脂高糖饲养大鼠体质量均显著高于普通饲养组，高脂高糖饲养后大鼠体质量显著增加的同时，前列腺重量、前列腺指数和普通饲养组相比显著升高(P<0.05)，表明高脂高糖饲养诱发的代谢综合征可导致前列腺增生。高脂高糖二甲双胍组与高脂高糖生理盐水组相比前列腺重量、前列腺指数明显降低(P<0.05)，说明胰岛素增敏剂可以改善代谢综合征所致的前列腺增生。见表1。

2.3前列腺组织HE染色普通饲养组大鼠前列腺无明显增生，腺上皮呈单层柱状或立方样改变，管腔扩大不明显，分泌物染色呈粉红色改变。高脂高糖空白对照组和高脂高糖生理盐水组大鼠前列腺腺体的体积明显增大，腺体层次增多，呈乳头样增生，接近腺腔短径1/3～1/2，腺体管腔增大，排列拥挤，间质内脂肪增多，小叶增多，分泌亢进。高脂高糖二甲双胍组前列腺增生程度较对照组减轻，上述组织学变化均在不同程度上改善，细胞层数减少，间质内脂肪细胞量减少，见图1。

表1　各组大鼠相关参数比较

与普通饲养组比较：*P<0.05；与高脂高糖生理盐水组比较：#P<0.05

图2　各组大鼠前列腺组织SRD5A2免疫组织化学染色　×200

2.4免疫组织化学染色检测SRD5A2的表达免疫组织化学染色结果显示正常前列腺组织和增生前列腺组织均表达SRD5A2，着色部位主要位于胞质内，以前列腺腺上皮着色为主，腺体的基底细胞与腺体间质细胞着色较浅。SRD5A2在增生前列腺中染色较深，且分布不均匀，增生前列腺结节内的染色要强于周围组织，尿道周围腺上皮细胞中SRD5A2的染色强度明显深于包膜下腺体。见图2。

2.5Westernblot检测SRD5A2的表达Western blot结果(图3)显示SRD5A2蛋白在高脂高糖饲养诱发代谢综合征组大鼠前列腺增生组织中高表达，表达量显著高于普通饲养组，二甲双胍干预后的代谢综合征大鼠前列腺组织中SRD5A2表达量显著降低。SRD5A2在大鼠前列腺中的表达与增生程度呈正相关性。

图3　各组大鼠前列腺组织中SRD5A2蛋白的表达

1：普通饲养组 2：高脂高糖空白对照组 3：高脂高糖生理盐水组4：高脂高糖二甲双胍组

3　讨论

目前我国人口老龄化加速，中国成为世界老年人口最多的国家，同时随着饮食结构的改变，老年病和代谢性疾病发病率逐年升高。有研究[7-8]显示代谢综合征和良性前列腺增生症的发生发展存在密切的联系。且高脂高糖饮食所致的代谢综合征及胰岛素抵抗，可能影响BPH发生发展的重要因素[4-5]。胰岛素抵抗指的是机体对胰岛素敏感组织对胰岛素的反应性降低，胰腺β细胞代偿性地分泌更多的胰岛素，因此出现代偿性高胰岛素血症。胰岛素抵抗和继发的高胰岛素血症是代谢综合征的基本特征[9]。稳态模型评估法(homeostasis model assessment，HOMA)广泛应用于评价胰岛素敏感性，其中HOMA-IR是最常用的评价个体胰岛素抵抗水平的指标[6]。本实验中高脂高糖饮食饲养的SD大鼠，测得HOMA-IR明显高于普通饲养组，证明代谢综合征模型成功建立。与普通饲养组相比，代谢综合征大鼠前列腺腺体的体积明显增大，腺体层次增多，分泌亢进等表现。这说明胰岛素抵抗可能是连接BPH和代谢综合征两种疾病的重要病因学纽带[10]。

先前有研究[11]表明胰岛素样生长因子家族蛋白(insulin-like growth factors, IGFs)轴可能是代谢综合征影响BPH的发生发展的关键环节，胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)与胰岛素生长因子-1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)是IGFs中两个重要的多肽蛋白，代谢综合征个体中高表达的IGF-1与列腺上皮细胞中同样高表达的IGF-1R相结合，活化后通过激活细胞PI3/AKT和MAPK信号通路，诱导DNA的转录和翻译，促进有丝分裂、细胞增殖及抑制细胞凋亡，从而诱发BPH。二甲双胍作为临床上常用的胰岛素增敏剂，广泛应用于治疗代谢综合征、Ⅱ型糖尿病、多囊卵巢综合征等胰岛素抵抗为核心的多种疾病[12]。研究[13]显示二甲双胍在抑制前列腺上皮细胞增殖的同时，显著下调IGF-1R活性，同时抑制IGF-1对于IGFs轴的活化功能，且二甲双胍通过对前列腺上皮细胞的周期调节蛋白家族表达功能下调，可将前列腺上皮细胞周期阻滞在静止期。本实验建立的模型显示代谢综合征大鼠前列腺增生明显，而二甲双胍干预后大鼠前列腺增生腺体组织学变化均在不同程度上得到改善。

SRD5A属于还原型辅酶Ⅱ依赖的膜结合酶，位于细胞的微粒体，具有将循环睾酮转化为双氢睾酮的生物学作用。有研究[14]显示SRD5A2主要在前列腺腺上皮细胞中表达，几乎是前列腺间质细胞中表达强度的2倍。有证据[15]表明，SRD5A2在增生的前列腺腺体中的表达与前列腺体增生程度呈正相关性，而经5-α还原酶抑制剂(非那雄胺)治疗后，前列腺尿道周围区体积缩小要比被膜下区更加明显。本研究通过免疫组织化学染色方法显示代谢综合征大鼠尿道周围腺上皮细胞中SRD5A2的分布多于包膜下腺体。SRD5A2蛋白在代谢综合征大鼠增生前列腺组织中的表达水平明显升高，经过二甲双胍干预后，SRD5A2的表达水平较高脂高糖生理盐水组显著降低，并且在前列腺组织的表达与BPH程度正相关。SRD5A2的表达及活性调控可能是代谢综合征所致大鼠前列腺增生过程中的关键环节。对胰岛素增敏剂和5-α还原酶抑制剂治疗效果的进一步研究，对揭示代谢综合征所致前列腺增生的机制和治疗靶点提供线索。