宫颈鳞癌中CD44分子变异体的表达分析

王　娟，宋伟国，申　震，吴大保，周　颖

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株人类宫颈癌细胞系SiHa、HeLa、ME-180细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2实验材料反转录试剂盒购自北京Promega公司；PrimerSTAR PCR酶购自日本TaKaRa公司；Agarose购自合肥志宏生物公司；单克隆鼠抗人CD44v6抗体购自英国Abcam公司；CD44s抗体购自北京中杉金桥公司；ECL化学发光底物购自美国BIO-RAD公司。组织切片来自安徽省立医院2005～2011年手术切除、并经病理诊断为宫颈鳞癌标本30例。

1.2方法

1.2.1细胞培养SiHa细胞用DMEM培养基，ME-180细胞用McCoy’s 5A培养基，加入10%胎牛血清(FCS)，青霉素10 U/ml和链霉素100 μg/ml,置于37 ℃、5% CO2的湿润环境中常规培养。

1.2.2qRT-PCR用TRIzol试剂抽取 SiHa、HeLa、ME-180细胞的总RNA，取500 ng RNA 反转成 cDNA。利用SYBR Green检测CD44各种变异体的表达量，β-actin为内参对照。引物序列见表1。在qRT-PCR分析软件中进行板布局，通过双Δ法分析数据。

第四，加强前期工作，全面加快水利基础设施建设步伐。重点水利工程前期工作取得新进展。太浦闸除险加固工程正在进行开工准备工作；加快太湖流域水资源监控与保护预警系统立项进程；新孟河、望虞河西岸控制工程、新沟河、太嘉河等工程正在加快推进。流域民生水利建设取得新发展。完成了流域片病险水库（水闸）除险加固初步设计复核工作，完成63个县山洪灾害防治县级非工程措施建设实施方案审核工作。直属项目建设取得较大突破。望亭水利枢纽更新改造工程已基本完成。浙皖水环境监测中心已经完建，青浦水文巡测基地、杭州湾水文基地、水环境监测中心实验室、太湖水行政执法基地建设全力推进。

1.2.3PCR和凝胶电泳采用图1B位置设计CD44各种亚型引物，具体引物序列见表1。以SiHa、HeLa、ME-180 CDNA为模板，相应引物进行PCR，产物跑2%的agarose胶验证条带大小，切胶送擎科生物测序。

1.2.4免疫组化将获得的宫颈鳞癌石蜡切片进行烤片、脱蜡、水化，于0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲修复液中微波加热抗原修复，待凉至室温，加3% H2O2溶液室温孵育30 min,山羊血清室温下封闭20 min,滴加1 ∶300 CD44v6、即用型CD44s单克隆抗体孵育4 h，滴加二抗室温反应30 min,DAB显色，苏木精浅染细胞核，中性树胶封片，显微镜下观察染色结果。免疫组化评分标准：随机选取至少3个视野，通过光学显微镜对组织切片根据着色强度评分：未着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性范围0～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分，最后综合两部分得分相乘，再进行比较。

表1　qRT-PCR引物序列

图1　CD44基因结构、可变剪切形式及引物设计

A:CD44不同剪切方式形成的常见亚型; B:CD44各种亚型引物设计位置

1.2.5Western blot法检测2×loading buffer收取状态好的SiHa、HeLa、ME-180细胞，超声裂解，蛋白变性后经SDS-PAGE电泳，转膜，5% BSA封闭，一抗CD44(1 ∶1 000)与actin(1 ∶1 000)过夜，TBST洗膜洗3次，加入相应的二抗孵育，洗膜ECL显影得到CD44v6与actin蛋白表达情况。

1.3统计学处理采用SPSS 16.0和GraphPad Prism6软件进行分析，两样本比较采用t检验，临床样本采用fisher精确性检验(样本量小于40)。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1SiHa、HeLa、ME-180宫颈鳞癌细胞系CD44变异体表达水平qRT-PCR结果显示，SiHa、HeLa细胞中可以检测到CD44s、v2～v10亚型，以v6亚型为主，其次为s亚型(P<0.0001)， ME-180细胞中可以检测到CD44s、v2～v10亚型，CD44v亚型明显高于CD44s亚型，以CD44v6为主(P=0.003)(图2A)。凝胶电泳结果进一步证实，SiHa、HeLa细胞系转录水平以CD44s、CD44v6变异体为主；ME-180细胞系主要表达CD44v型变异体，以CD446型变异体为主(图2B)。

2.2SiHa、HeLa、ME-180宫颈鳞癌细胞系均表达CD44v6亚型鉴于子宫颈鳞癌细胞系中转录水平检测到的CD44的主要亚型为v6，通过Western blot在蛋白水平检测CD44v6亚型，结果确证了SiHa、HeLa、ME-180宫颈癌细胞系均表达CD44v6亚型，见图3。

2.3宫颈鳞癌组织中CD44v6蛋白表达鉴于子宫颈鳞癌细胞系中转录及翻译水平检测到的CD44的主要亚型为v6，因此，对30例宫颈鳞癌组织进行免疫组化检测其细胞定位情况，结果显示CD44v6定位于细胞质和细胞膜，呈深浅不同的棕黄色，见图4。

2.4CD44v6强表达与宫颈鳞癌分期、淋巴结转移、预后的关系进一步选择了30例宫颈鳞癌组织进行分析，结果显示CD44v6阳性者29例(96.70%)，鉴此，根据免疫组化评分，将CD44v6表达分为强阳性(≥9分)，弱阳性(<9分)，并根据宫颈鳞癌分期、淋巴结转移情况、预后、分化程度进行分析，结果显示，宫颈鳞癌患者的临床分期越晚、有淋巴结及远处器官转移、患者的生存期越短的癌组织中CD44v6基因表达水平越高,与分化程度无关(表2)。

图2　qRT-PCR、凝胶电泳检测SiHa、HeLa、ME-180宫颈癌细胞系中CD44各亚型mRNA表达水平A：qRT-PCR; B:凝胶电泳

图3　Western blot法检测子SiHa、HeLa、ME-180宫颈癌细胞株中的CD44v6蛋白水平

3　讨论

可变剪切是指同一个基因不同外显子以多种方式重连，形成不同的mRNA，由此产生了不同的蛋白。可变剪接参与很多重要的生命活动，包括细胞凋亡、细胞生长、血管生成、细胞运动和EMT等[6]。CD44作为拥有多种可变剪切方式的I型跨膜糖蛋白家族，近来备受关注。CD44是HA受体，主要调控细胞与细胞及ECM间的黏附作用，CD44基因经过选择性剪切和大量转录后修饰形成了多种CD44变异体，不同变异体生物学功能各不相同[7-8]，如CD44s存在于大部分真核细胞中， 而CD44v主要表达于炎症和肿瘤细胞。有研究显示CD44各亚型通过激活STAT3[9]、Snail[10]、Wnt等信号途径以及miR-106b[11]来调节肿瘤的侵袭和转移,然而也有学者持相反的观点[12]。最近研究表明,在胰腺癌[5]、胃癌[13]、乳腺癌的癌变中均有CD44s变异体转向CD44v6，可能是因为CD44v6使存在于肿瘤细胞表面粘附因子的形态与功能发生改变，利于肿瘤细胞的扩散与转移[14]。由于CD44各亚型在肿瘤进展的作用说法不一[5]，宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，明确宫颈癌CD44分子变异体的表达情况是判断CD44各亚型功能的前提。

图4　免疫组化检测宫颈癌组织中CD44v6蛋白的表达水平及部位

因素nCD44v6表达+-P值CD44v6表达强阳性≥9分<9分P值分期 ≤Ⅱ期18171810 >Ⅱ期121200.6001110.010分化程度 高、中1716198 低131300.5671030.167淋巴结转移 无232211211 有7700.767700.025生存期 ≥5年212011011 <5年9900.700900.012

本研究表明，在宫颈鳞癌细胞系SiHa、HeLa、ME-180中CD44各亚型表达情况并非相同，在 SiHa和HeLa是以CD44s和CD44v6变异体为主，而ME-180CD44v型明显高于CD44s型，以CD44v6为主。多篇文章报道可变剪切涉及各种生物过程，包括细胞循环、能量运输、生长发育和信号转导，可变剪切失调导致人类疾病包括癌症[15]。更有报道[13]表明癌变中有CD44s变异体转向CD44v6。在宫颈癌细胞系存在明显的可变剪切形式的不同，这种不同是否导致肿瘤的扩散及转移仍需进一步阐释，需要进一步深入讨论。值得注意的是，CD44v6在这三种宫颈鳞癌细胞系均有很高的表达，并通过宫颈鳞癌组织中也同样证实了这点，免疫组化结果显示CD44主要位于宫颈癌细胞膜和细胞质，是一个多结构多功能的跨膜糖蛋白，与选择素、整合素和钙黏蛋白一起构成巨大的CAMs，而CAM通过介导细胞间或细胞与基质间的黏附来调控组织的完整性，故其表达部位可能与肿瘤的侵袭转移相关。30例宫颈癌组织CD44v6表达率高达96.70%，且本研究结果显示，CD44v6蛋白表达水平与肿瘤的临床分期、淋巴结转移受累、不良预后正相关。提示CD44v6在宫颈鳞癌的发生发展中可能发挥了重要的作用，可能作为宫颈鳞癌预后的指标。

参考文献