益母草碱在大鼠急性内毒素性葡萄膜炎 模型中的保护作用

熊佳伟 顾纪锋 石碗如 吴甦潜 麦尔哈巴·肖开提 朱依谆 莫晓芬△

(1复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科, 2药剂科 上海 200031; 3澳门科技大学药学院 澳门 999078;4复旦大学药学院药理学与生物化学教研室 上海 201203)

益母草碱(leonurine,SCM-198)作为益母草主要活性成分之一,最初因其在心脑血管系统疾病中能够发挥抑制血小板聚集、降低外周血管阻力、减轻氧化应激损伤、调节L型Ca2+通道活性等作用而受到关注[1-3]。进一步研究发现,它还能通过下调TLR4及NF-κB活化,影响一系列下游信号转导通路,在全身多种炎症性疾病中发挥强大的抗炎作用,且无明显不良反应[4-6]。眼科多种疾病(如葡萄膜炎等)均与炎症关系密切。由于血-房水屏障(blood-aquaous-barrier,BAB)、血-视网膜屏障(blood-retina-barrier,BRB)等血-眼屏障的存在,全身给药的抗炎治疗效果不明显、不良反应大,而局部治疗(如眼内注射等)又存在并发症风险等问题,故亟需寻找抗炎作用稳定、给药方便、不良反应可控的新药。SCM-198在急性乳腺炎、急性肾损伤等动物模型的前期研究中已被证实具有稳定的抗炎作用[5-6],且作为小分子化合物,其可透过血-眼屏障,由此带来其在眼科疾病治疗方面潜在的应用前景。本研究系首次在葡萄膜炎大鼠模型上开展益母草碱作用的研究,通过灌胃方式给药,研究了 SCM-198在SD大鼠急性内毒素性葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis,EIU)模型中的保护作用,并初步探讨可能的作用机制。

材 料 和 方 法

动物、主要试剂及仪器SPF级雄性SD大鼠36只(上海西普尔-必凯实验动物有限公司),初始体重180～200 g。0.9% NaCl注射液(浙江天瑞药业有限公司);地塞米松磷酸钠注射液(山东辰欣药业股份有限公司);SCM-198(复旦大学药学院朱依谆教授课题组惠赠);甲苯塞嗪盐酸盐(美国Sigma Aldrich公司);盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司);S.typhiLPS(美国Sigma Aldrich公司);TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1一抗,对应二抗(英国Abcam公司),BCA试剂盒(美国Sigma Aldrich公司)。33 Ga显微注射器(瑞士Hamilton公司);Espion E2小动物ERG检测系统(美国Diagnosys公司);眼科显微手术系统(苏州六六视觉科技股份有限公司)。

实验方法及检测指标记录体重后将全部大鼠随机分为3组:阴性对照组6只,每日0.9% NaCl注射液10 mL/kg体重灌胃;阳性对照组6只,每日50 mg/L地塞米松磷酸钠溶于生理盐水注射液10 mL/kg体重灌胃;实验组4个亚组、每个亚组6只,分别以每日每千克体重10、20、40、80 mg的SCM-198生理盐水灌胃。共21天,组间饲养无差异,其间每7天记录体重。第18天灌胃结束后,各组大鼠以加入0.018 75 g/mL甲苯塞嗪盐酸盐的0.05 g/mL盐酸氯胺酮注射液4 mL/kg体重腹腔注射麻醉、充分暗适应(2 h)后行ERG检测;第21天灌胃后以1 g/L的伤寒沙门氏菌(S.typhi) LPS生理盐水溶液0.1 mL于全部大鼠左足底注射建立EIU模型[7],造模后24 h再次如上麻醉并行ERG检测;之后由2位有经验的眼科医师于双盲下行裂隙灯下双眼炎症评分[8],方法如表1,33 Ga显微注射器于手术显微镜下取左眼房水(-80 ℃保存)后处死动物。即刻取右眼眼球,固定后石蜡包埋切片,HE染色,光学显微镜下图像采集观察,留取白片,免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色检测TNF-α、ICAM-1的表达。对留取的房水解冻、BCA法测定蛋白浓度,Western blot检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、细胞间黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)表达。

表1 大鼠葡萄膜炎临床评分指标Tab 1 Scoring system for clinical evaluation of uveitis [8]

结 果

TimeSCM-198 (mgkg-1d-1)80 402010Negative control Positive control Before235±27235±28235±32221±29230±29234±277th day274±19277±11272±34255±49260±29216±2914th day269±31286±27276±32268±53271±37209±2621st day265±25296±32277±27285±54278±34188±16

ItemSCM-198 (mgkg-1d-1)80 402010Negative controlPositive controlOS3.29±1.073.50±1.243.25±1.983.00±1.763.36±1.801.75±0.89OD3.21±1.373.50±1.243.38±1.773.10±1.793.27±1.901.88±1.13

OS:Oculus sinister;OD:Oculus dexter.

图1 各组大鼠虹膜睫状体(A)和玻璃体视网膜(B) HE染色结果Fig 1 The HE staining results of iris and ciliary body (A),retina and vitreous (B) in rats

图2各组大鼠TNF-α(A)和ICAM-1(B)IHC检测结果
Fig2TheIHCresultsofTNF-α(A)andICAM-1(B)inrats

图3各组大鼠房水Westernblot结果
Fig3TheWesternblotresultsofaqueoushumorinrats

讨 论

与炎症相关的眼部病变是不可逆性致盲的重要原因,如葡萄膜炎,好发于中青年人群,多与自身免疫因素相关、可伴或不伴全身疾病,可复发缓解,临床治疗较为棘手。基础和临床研究亦证实,糖尿病视网膜病变发病过程中,长期低度炎症反应刺激是病情进展的重要原因[9-10]。传统抗炎治疗以激素、免疫抑制剂等药物为主,局部或全身应用均有较为明显的不良反应,眼部长期应用激素可致激素性青光眼、白内障,免疫抑制剂局部应用刺激性较强;全身应用激素可致体型改变、骨质疏松、消化道溃疡等,免疫抑制剂长期应用影响生育功能、升高恶性肿瘤发病风险等。综上,传统药物治疗炎症相关性眼病受到较大限制。本研究中,虽然地塞米松能在EIU模型大鼠中发挥较强的抗炎作用,但该组大鼠处于高分解代谢状态、体重显著减轻且显著低于其他各组,存在明显不良反应,该项结果也与既往研究结果一致。造模前ERG检测结果显示,各组大鼠视网膜功能未见异常,亦未见其他不良反应,可见SCM-198和地塞米松以本研究所用剂量灌胃21天,眼部安全性良好。

SCM-198近年来被证实可在多器官、系统中发挥明显的抗炎作用。其作用机制主要有两种途径,一是以直接下调TLR4活化为核心,TLR4广泛存在于巨噬细胞等炎症细胞表面,下调其活化可降低多种炎症介质表达[5,11-12];二是以下调NF-κB活性为核心,进而下调IκB水平,抑制PI3K/Akt、ERK/MAPK、AP-1等多条下游通路,降低多种炎症因子表达[4-6]。本研究所采用的EIU模型中,LPS诱导急性内毒素性葡萄膜炎的发病机制主要是LPS经血液循环,作用于葡萄膜固有组织巨噬细胞表面TLR4,激活巨噬细胞释放TNF-α、IL-1β等炎症因子,并进一步上调其他炎症因子如IL-6的表达,IL-6进一步激活巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等[13];同时LPS诱导的感染应激状态下ROS大量产生,进而激活NF-κB,升高下游炎症介质的表达[6,14]。因此,SCM-198针对性下调上述通路的激活,进而下调对应炎症因子表达,这种变化在本研究中也得到了形态学变化的佐证,因此SCM-198在EIU模型中的抗炎作用是明确的。然而,人类葡萄膜炎病理生理机制仍待明确,远比EIU模型复杂。已证实的包括BAB和BRB破坏导致的炎症细胞浸润、多种炎症介质过表达,周围炎症细胞暴露于细胞因子和趋化因子环境中引发的级联反应,及ROS激活导致的多条下游信号通路激活产生的级联反应等。因此SCM-198在临床工作中的价值有待深入研究。

本研究采用的模型是LPS介导的急性全葡萄膜炎。既往文献报道,大鼠造模后4 h内出现虹膜血管扩张、睫状充血,6 h出现前房闪辉、细胞和纤维素渗出、18～24 h炎症反应达到最高峰[7,15],48 h左右炎症反应开始缓解并在4～7天后完全消失[15]。炎症因子中表达最先上升的是TNF-α和IL-1β,二者能够上调IL-6的表达,造模后24 h IL-6表达显著升高;炎症恢复期则表现为IL-10、IL-12、TGF-β等保护性因子表达上升[13,16]。本研究取样的时点是造模后24 h的炎症反应最高峰。因此裂隙灯下和组织病理学形态均观察到明显变化。由于TNF-α和IL-1β是最先出现的炎症因子,故其表达变化和SCM-198对其产生的抑制作用最为明显,甚至表达低于阳性对照组;IL-6出现晚于两者,故虽观察到SCM-198的和DEX对其表达的抑制作用,但各组间差距不如前两者明显。

眼科炎症相关性疾病一直以来是治疗难点和研究热点。近年来传统药物单体、单克隆抗体研发成为热点研究方向。日本学者报道茜草素在EIU模型抗炎中取得良好效果[19-20],其作用机制也与减轻氧化应激损伤及后续级联反应相关,与本研究异曲同工。多个TNF-α单克隆抗体治疗HLA-B27相关性葡萄膜炎的临床试验也取得成效[21]。此类药物与传统抗炎药物作用机制不同,靶向更精准,因而不良反应更轻微、可控,未来发展前景广阔。本研究中选取的SCM-198已是应用于临床的成熟药物,未来如能应用于眼科领域,将为此类疾病治疗作出贡献。

下一步研究中,我们将致力于对SCM-198应用于眼部抗炎的最佳给药方式、给药剂量给出更深入的回答。总之,SCM-198灌胃给药对EIU模型大鼠具有保护作用,SCM-198作为潜在的眼科抗炎药物,值得进一步研究。

参 考 文 献

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