NOB1调控Wnt/ β-catenin信号通路影响膀胱癌细胞凋亡的实验研究

胡国森，吴晓杰

(河南科技大学第二附属医院泌尿外科,河南洛阳 471000)

膀胱癌在中国泌尿生殖系统恶性肿瘤中的发病率排名第1，其发病率在世界范围内的全部恶性肿瘤中位居第7位，手术治疗、放化疗等是目前膀胱癌治疗的主要方法，随着人们对肿瘤发病机制的不断探索，靶向基因治疗肿瘤逐渐成为肿瘤治疗的重点[1-2]。酵母基因Noblp人类同源基因(nin ond bind protein，NOB1)与核糖体形成和溶酶体的合成有关，是一种与核糖体装配有关的蛋白，其在人体组织中表达水平不同，在肺组织、肝脏等中表达水平较高，而在结肠、肾脏等组织中表达水平较低[3]。近年来的研究显示，NOB1参与恶性肿瘤的发生，在肿瘤组织中表达上调，而人为的下调肿瘤细胞中NOB1表达后，胶质瘤、结肠癌等癌细胞的增殖能力降低，凋亡水平升高[4-5]。Wnt/β-catenin是Wnt多种信号通路中的经典信号通路，参与肿瘤的发展，与细胞的凋亡等有关，参与细胞内多种癌基因或者是抑癌基因生物学功能的作用过程[6-7]。本研究以膀胱癌细胞为研究对象，下调细胞中NOB1的表达，探讨NOB1在膀胱癌细胞凋亡中的作用及机制，以期为靶向NOB1治疗膀胱癌提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料膀胱癌BIU-87细胞购自于上海信裕生物科技有限公司；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Permix Ex TaqⅡ荧光定量PCR试剂盒购自于大连Takara；RNA simple总RNA提取试剂盒购自于北京天根；BCA Protein Assay Kit购自于碧云天；Annexin V 凋亡检测试剂盒(FITC/PI双染法)购自于上海生工；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)一抗、β-连环蛋白(β-catenin)一抗购自于美国Cell Signaling CST；细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)一抗购自于美国Abcam；甘油醛-3-磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗购自于美国Sigma；NOB1 siRNA和siRNA control由山东维真构建；NOB1、GAPDH引物由上海生工合成；Lipofectamine2000购自于美国Thermo；Wnt/β-catenin抑制剂XAV939购自于美国StemRD；电化学发光(Electro-Chemi-Luminescence，ECL)发光试剂盒购自于碧云天。

1.2细胞培养及转染膀胱癌BIU-87细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养，在饱和湿度、37℃、5% CO2培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化。BIU-87细胞培养至对数期后，用Lipofectamine2000分别在细胞中转染NOB1 siRNA、siRNA control，并命名为干扰组、阴性组，同时以不做转染的细胞为对照组。

1.3qRT-PCR检测NOB1水平对照组、阴性组、干扰组转染后培养2 d，收集细胞，提取细胞RNA，步骤参照RNA simple总RNA提取试剂盒。反转录合成cDNA，用SYBR Permix Ex TaqⅡ试剂盒进行PCR反应。反应条件为：95℃预变性30s，(95℃ 5 s,60℃ 30 s)×40个循环。内参为GAPDH，2-△△Ct法分析NOB1水平。NOB1 F：5′-GAAAGAACAACGCCCTGGAG-3′，R：5′-CAGCCTTGAGATGACCTAAGC-3′。GAPDH F：5′-CG GAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，R：5′-AGC CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.4Westernblot检测NOB1水平对照组、阴性组、干扰组转染后培养2 d，提取细胞蛋白，用BCA Protein Assay Kit对蛋白样品进行定量。在蛋白样品中加入1/4体积的5×上样缓冲液，煮沸5 min。选用10%的分离胶和5%的浓缩胶进行电泳。蛋白上样量为50 μg，80 V电压观察上样缓冲液进入到分离胶和浓缩胶的交界处，把电压升高到120 V，待蛋白marker彻底分离后，停止电泳。转膜：90 V 转膜60 min。将膜放在5%脱脂奶粉中，摇床孵育60 min。按照NOB1一抗1∶800稀释、GAPDH一抗1∶1 000稀释，将膜放在一抗中，4℃孵育过夜。1∶2 000稀释山羊抗兔二抗，室温孵育60 min。ECL发光后，用Quantity-One分析条带的吸光度值，以GAPDH为内参进行半定量分析。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡对照组、阴性组、干扰组转染后培养2 d，加入500 μL的Binding Buffer混合后，加入5 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜联蛋白 V-FITC(annexin V-FITC)，避光反应15 min。在1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。同时收集培养2 d的对照组、阴性组、干扰组细胞，Western blot检测细胞中Cleaved Caspase-3和Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin、cyclinD1水平，步骤同1.4。Cleaved Caspase-3一抗1∶600稀释、β-catenin一抗1∶1 000稀释、Cyclin D1一抗1∶800稀释。

1.6抑制Wnt/β-catenin信号通路对膀胱癌细胞凋亡的影响干扰组细胞加入10μmol/L的Wnt/β-catenin抑制剂XAV939记为干扰+XAV939组，培养2 d后，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot检测Cleaved Caspase-3、β-catenin、CyclinD1蛋白水平，步骤同1.4和1.5。

2 结 果

2.1NOB1siRNA降低细胞中NOB1mRNA和蛋白水平阴性组细胞中NOB1 mRNA和蛋白水平与对照组相比差异均没有统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞中NOB1 mRNA和蛋白水平与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。NOB1 siRNA可以下调膀胱癌细胞中NOB1水平(图1、表1)。

图1Westernblot检测NOB1siRNA降低细胞中蛋白表达

组别 NOB1 mRNANOB1蛋白对照组 1.00±0.00 0.65±0.06阴性组 1.02±0.11* 0.64±0.09*干扰组 0.41±0.05# 0.26±0.02#F值74.03436.767P值0.0000.000

注：与对照组比，t1=0.351,t2=0.193,*P>0.05;与对照组比，t1=10.358,t2=7.521,#P<0.05。

2.2下调NOB1促进Caspase-3介导的细胞凋亡阴性组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3水平与对照组相比差异均没有统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3水平与对照组相比明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。下调NOB1促进膀胱癌细胞凋亡，诱导膀胱癌细胞中Caspase-3活化(图2、表2)。

组别 凋亡率Cleaved Caspase-3水平对照组11.62±1.24 0.54±0.06阴性组11.17±1.39* 0.58±0.04*干扰组39.25±3.64# 1.04±0.09#F值139.25052.241P值0.0000.000

注：与对照组比，t1=0.234,t2=0.736,*P>0.05;与对照组比，t1=14.334,t2=9.197,#P<0.05。

图2 下调NOB1促进Caspase-3介导的细胞凋亡

2.3下调NOB1抑制Wnt/β-catenin信号通路激活阴性组细胞β-catenin、Cyclin D1水平与对照组相比差异均没有统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞β-catenin、Cyclin D1水平与对照组相比明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。下调NOB1降低膀胱癌细胞中β-catenin、Cyclin D1表达水平，抑制Wnt/β-catenin信号通路激活(图3、表3)。

图3Westernblot检测下调NOB1细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达

组别β-cateninCyclin D1对照组0.44±0.04 0.61±0.05阴性组0.45±0.06* 0.64±0.07*干扰组0.21±0.03# 0.29±0.04#F值27.19737.633P值0.0010.000

注：与对照组比，t1=0.272,t2=0.671,*P>0.05;与对照组比，t1=6.247,t2=7.155,#P<0.05。

2.4Wnt/β-catenin抑制剂XAV939促进细胞凋亡干扰+XAV939组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3水平与干扰组相比明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。Wnt/β-catenin抑制剂XAV939促进NOB1下调诱导的膀胱癌细胞凋亡，下调NOB1和抑制Wnt/β-catenin信号通路具有协同作用，均能够促进膀胱癌细胞凋亡(图4、表4)。

图4Wnt/β-catenin抑制剂XAV939对细胞凋亡影响

A：流式细胞术检测细胞凋亡；B：Western blot检测细胞中Cleaved Caspase-3水平。

组别凋亡率Cleaved Caspase-3水平干扰组35.26±3.170.95±0.08干扰+XAV939组47.72±3.94#1.37±0.12#

注：与干扰组比，t1=4.268,t2=5.044,#P<0.05。

2.5Wnt/β-catenin抑制剂XAV939下调β-catenin、CyclinD1蛋白水平干扰+XAV939组细胞β-catenin、Cyclin D1水平与干扰组相比明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。Wnt/β-catenin抑制剂XAV939能够进一步降低NOB1下调对β-catenin、Cyclin D1的抑制作用，下调NOB1和Wnt/β-catenin抑制剂XAV939具有协同作用，均能够抑制膀胱癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的激活(图5、表5)。

图5 Western blot检测抑制Wnt/β-catenin信号通路后细胞中β-catenin、Cyclin D1蛋白的水平

组别β-cateninCyclin D1干扰组0.26±0.040.31±0.04干扰+XAV939组0.15±0.02#0.12±0.03#

注：与干扰组比，t1=4.260,t2=6.582,#P<0.05。

3 讨 论

NOB1基因有8个内含子、9个外显子，位于16号染色体上，其编码的蛋白质由412个氨基酸组成，在其N端含有一个PIN结构，该结构由100个氨基酸组成，在其C端含有一个锌带结构，PIN结构与核糖体蛋白的生成有关，锌带结构参与基因转录过程[8-9]。NOB1在处于生长期的细胞中大量表达，而在静止的细胞中几乎不表达，当细胞进入静止期时，NOB1蛋白能够被26S蛋白酶体分解[10-13]。后续的研究报道表明，NOB1还参与40S核糖体的转运，其PIN结构还可以与RNA酶结合，除此以外，NOB1在骨肉瘤等肿瘤细胞周期、增殖、凋亡等过程中均具有重要作用[14-17]。黄伟翼等[18]的研究显示，下调NOB1表达后的乳腺癌细胞恶性程度降低。本研究在膀胱癌细胞中转染了NOB1小干扰RNA，并通过qRT-PCR和Western blot结果验证成功构建了NOB1下调的膀胱癌细胞，通过流式细胞术检测发现，下调NOB1后的膀胱癌细胞凋亡率下降，说明抑制NOB1可以诱导膀胱癌细胞凋亡，这与之前的研究报道相符合，说明NOB1表达下调后抑制肿瘤发展。

Caspase与细胞凋亡有关，该蛋白家族含有多个蛋白成员，根据在级联反应中的作用可以分为凋亡起始因子、执行因子等，Caspase-3是Caspase级联反应的凋亡执行因子，正常状态下，Caspase-3没有活性，以酶原的形式存在，当受到相关因子刺激后，活化水平升高，促进细胞凋亡的发生，Caspase-3活化也是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[19]。本研究结果显示，下调NOB1表达后的膀胱癌细胞中Caspase-3活化水平升高，说明下调NOB1可以诱导Caspase-3介导的细胞凋亡。

Wnt/β-catenin在胚胎发育、细胞内环境稳定维持等过程中具有重要作用，是Wnt中经典的信号通路，该信号通路包含低脂密度蛋白受体相关蛋白、卷曲蛋白、β-catenin等多个组成部分，其中β-catenin是关键蛋白，β-catenin在正常的细胞中与细胞膜上的E-cadherin形成复合物，该复合物能够被糖原合成激酶、酪蛋白酶等降解，当Wnt/β-catenin信号通路被激活后，糖原合成激酶、酪蛋白酶等活性降低，导致β-catenin不能被及时降解，积累在细胞质中的β-catenin进入细胞核，促进下游靶基因cyclinD1的表达[20-21]。研究显示，Wnt/β-catenin在膀胱癌组织中过度激活，肿瘤组织中β-catenin、Cyclin D1水平升高，用Wnt/β-catenin抑制剂处理肿瘤细胞，细胞的生长能力降低，细胞凋亡增多[22-23]。本研究结果显示，下调NOB1后膀胱癌细胞中β-catenin、Cyclin D1水平下降，Wnt/β-catenin信号通路被抑制，用Wnt/β-catenin抑制剂作用后，细胞凋亡水平更高，说明Wnt/β-catenin抑制剂和下调NOB1具有协同作用。

我们的实验证明，下调NOB1可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路促进膀胱癌细胞凋亡，促进膀胱癌细胞中Caspase-3的活化，为研究NOB1在肿瘤中的作用提供了理论依据，对于研究肿瘤的发病机制具有重要意义。靶向基因治疗具有准确性高、安全等优点，NOB1可能是治疗膀胱癌的潜在靶点。

参考文献：

[1] LEVIN D，BELL S，SUND R，et al.Pioglitazone and bladder cancer risk：a multipopulation pooled，cumulative exposure analysis[J].Diabetologia，2015，58(3):493-504.

[2] KURTOVA A V，XIAO J，MO Q，et al.Blocking PGE2-induced tumour repopulation abrogates bladder cancer chemoresistance[J].Nature，2015，517(7533):209-213.

[3] LIU K，GU M M，CHEN HL，et al.NOB1 in non-small-cell lung cancer：expression profile and clinical significance[J].Pathol Oncol Res Por，2014，20(2):461-466.

[4] 贺孝文，陶峰，骆珊珊,等.慢病毒介导的NOB1基因沉默对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响[J].中华胃肠外科杂志，2012，15(11):1182-1186.

[5] 王洪亮，李平，赵兵.NOB1影响胶质瘤细胞增殖、凋亡的实验研究[J/OL].中华临床医师杂志，2013，7(4):142-145.

[6] BENARY U，KOFAHL B，HECHT A，et al.Mathematical modelling suggests differential impact of β-TrCP paralogues on Wnt/β-catenin signalling dynamics[J].Febs J，2015，282(6):1080-1096.

[7] GHAHHARI NM，BABASHAHS.Interplay between microRNAs and WNT/β-catenin signalling pathway regulates epithelial-mesenchymal transition in cancer[J].Eur J Canc，2015，51(12):1638-1649.

[8] LIU K，CHEN HL，GU MM，et al.Relationship between NOB1 expression and prognosis of resected non-small cell lung cancer[J].Int J Biol Markers，2015，30(1):43-48.

[9] LIN S，MENG W，ZHANG W，et al.Expression of the NOB1 gene and its clinical significance in papillary thyroid carcinoma[J].J Int Med Res，2013，41(3):568-572.

[10] 裴振，霍小蕾，李代强.NOB1基因及其与肿瘤的研究进展[J].齐齐哈尔医学院学报，2011，32(22):3688-3690.

[11] MA Y，ZHOU W，HONG L，et al.Establishment of a novel monoclonal antibody L6 specific to NOB1[J].Monoclon Antib Immunodiagn Immunother，2016，35(2):100-103.

[12] HUANG W，ZHONG W，XU J，et al.Lentivirus-mediated gene silencing of NOB1 suppresses non-small cell lung cancer cell proliferation[J].Oncol Rep，2015，34(3):1510.

[13] XIAO W，FENG，QIAO L，et al.NOB1 is essential for the survival of RKO colorectal cancer cells[J].World J Gastroenterol，2015，21(3):868-877.

[14] LIU K，CHEN HL，GU MM，et al.NOB1 expression predicts early response to cisplatin-based chemotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer[J].J Chemotherapy，2016，28(3):225-229.

[15] WANG J，CAO L，WU J，et al.Long non-coding RNA SNHG1 regulates NOB1 expression by sponging miR-326 and promotestumorigenesis in osteosarcoma[J].Int J Oncol，2018，52(1):77-88.

[16] 陈炳鹏.NOB1 在骨肉瘤中的功能和作用机制研究[D].吉林大学，2014:10-30.

[17] Lamanna A C，Karbstein K.Nob1 binds the single-stranded cleavage site D at the 3′-end of 18S rRNA with its PIN domain[J].Proceed National Acad Sci，2009，106(34)：14259-14264.

[18] 黄伟翼，李宁，陈栋晖.靶向沉默NOB1基因对乳腺癌细胞MCF-7生长和周期分布的影响[J].中国癌症杂志，2012，22(6):452-457.

[19] 刘安，刘龙强，张建勋.硒化麒麟菜多糖对膀胱癌细胞生长、凋亡的作用及Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响[J].现代泌尿外科杂志，2017，22(9):700-704.

[20] LIAN X，ZHANG J，AZARIN SM，et al.Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions[J].Nature protocols，2013，8(1)：162-175.

[21] CHOI Y S，ZHANG Y，XU M，et al.Distinct functions for Wnt/β-catenin in hair follicle stem cell proliferation and survival and interfollicular epidermal homeostasis[J].Cell Stem Cell，2013，13(6)：720-733.

[22] JANG G B，HONG I S，KIM R J，et al.Wnt/β-catenin small-molecule inhibitor CWP232228 preferentially inhibits the growth of breast cancer stem-like cells[J].Canc Res，2015，75(8)：1691-1702.

[23] YU T，LIU K，WU Y，et al.MicroRNA-9 inhibits the proliferation of oral squamous cell carcinoma cells by suppressing expression of CXCR4 via the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Oncogene，2014，33(42)：5017-5027.