荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV接触感染仔猪增殖动态

夏文龙， 余树培， 吴 植， 郭长明， 卢会鹏， 孙怀昌， 朱善元

(1.江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州 225300；2.扬州大学兽医学院/江苏省重要动物疫病与人兽共患病协同创新中心，江苏扬州 225009)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，以母猪繁殖障碍和仔猪及育肥猪呼吸道疾病为主要特征[1]。该病于1987年在美国和加拿大首次发现并迅速蔓延到世界各地，给全球养猪业造成了巨大经济损失[2]。2006年，我国大规模暴发以高热、高死亡率为主要特征的PRRS疫情，研究表明其主要病原为高致病性PRRSV变异株[3]，鉴于PRRSV具有复杂的感染及免疫逃避机制[4]，目前防控手段无法将其净化和根除。

PRRS主要依靠疫苗接种进行预防控制，近年来，有许多学者利用micro-RNA[5]、干扰素[6]、受体阻断[2]等新策略进行抗病毒研究，而这些研究前提是具备稳定、可靠的动物模型，以便评价其保护效果。目前，PRSSV人工感染仔猪主要是通过肌肉注射和滴鼻方式接种[7-8]，缺少接触感染的相关研究资料，为了模拟PRRSV在猪群内的自然扩散，本试验通过同居饲养方式在健康猪中引入PRRS病猪，并建立荧光定量RT-PCR方法，动态监测感染仔猪的病毒血症和排毒水平，为进一步了解PRRSV的传播机制和建立防治PRRSV感染的仔猪模型提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

AxyPrep质粒DNA小提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司；rTaqDNA聚合酶、pMD-18T载体、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix ExTaqⅡ为日本TaKaRa公司产品；PRRS ELISA检测试剂盒为美国IDEXX公司产品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病毒和试验动物

猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、高致病性PRRSV JXA1毒株均由笔者所在实验室保存；PRRS阴性仔猪购于江苏省如东某养殖场，动物试验在江苏农牧科技职业学院新兽药研发临床试验中心进行。

1.3 标准品制备

按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit操作说明，从PRRSV JXA1病毒液中提取RNA，参考TaKaRa PrimeScript RT Master Mix试剂盒提供的反应体系进行反转录，将获得的cDNA作为模板，利用针对PRRSV ORF7编码序列的特异性引物(F：5′-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3′，R：5′-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3′)，进行PCR扩增，回收目的片段后，连接pMD-18T载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并送测序，鉴定正确的重组质粒作为标准品。

1.4 标准曲线绘制

将标准品10倍梯度倍比稀释作为模板，按照TaKaRa SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒说明书配制反应体系并在ABI 7300仪器上进行荧光定量PCR反应条件的设置，优化后的反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火并延伸31 s，共扩增40个循环，延伸结束收集荧光信号；最后于60～95 ℃过程中制作熔解曲线。

1.5 重复性试验

为验证该方法重复性，随机选取3个不同稀释度的标准质粒作为模板，重复3次扩增，记录各模板CT值，计算其变异系数，变异系数=标准偏差/平均数。

1.6 敏感性、特异性试验

将不同稀释度的标准品作为模板，分别进行常规RT-PCR扩增以及实时荧光PCR试验，以确定2种方法所能检测的最低拷贝数，进行灵敏度比较；分别以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)RNA反转录得到的cDNA，猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)DNA为模板，并设立空白对照，在相同条件下进行实时荧光PCR反应，分析扩增曲线及CT值，验证本方法的特异性；将PRRSV cDNA和标准品质粒作为模板进行荧光定量PCR反应后，观察溶解曲线，确保无引物二聚体及非特异扩增。

1.7 动物试验分组

将8头28日龄断奶仔猪平均分为2组，每组4头，置于2个负压隔离器中饲养3～5 d，观察无异样表现，前腔静脉采集血液并分离血清，经ELISA检测PRRSV特异性抗体为阴性；提取RNA后，通过上述RT-PCR方法检测PRRSV抗原阴性。第1组作为攻毒组，随机选择1头仔猪肌肉注射和滴鼻接种PRRSV JXA1(1×105TCID50)，与其余3头健康仔猪同居饲养；第2组作为空白对照组，接种相同量DMEM细胞培养液；试验期间每日观察并记录各仔猪临床症状。

1.8 病毒血症检测

在同居饲养后1、3、5、7、10、13 d，前腔静脉采集每组仔猪血液5 mL并分离血清，取200 μL提取病毒RNA，根据上述定量RT-PCR方法，检测各血清样品中病毒基因组拷贝数。

1.9 粪便排毒检测

在同居饲养后1、3、5、7、10、13 d，采集每组仔猪粪便1 g并用10 mL PBS溶液重悬，8 000g离心10 min后取200 μL上清，根据上述定量RT-PCR方法，检测各粪便样品中PRRSV基因组拷贝数。

2 结果与分析

2.1 标准质粒鉴定

通过常规RT-PCR成功扩增预期大小的130 bp目的片段(图1)，克隆至pMD-18T载体，获得重组质粒pMD-ORF7，测序结果表明，扩增的cDNA基因片段和已发表PRRSV ORF7(GenBank登录号：EF112445)编码序列的同源性为99.7%。利用紫外分光光度计测其D260 nm值，根据计算公式[9]：质粒拷贝数(拷贝/μL)=6.02×1023×质粒浓度/平均分子量，换算标准质粒拷贝数为2.18×109拷贝/μL。

2.2 标准曲线建立和重复性试验

将标准质粒连续10倍系列稀释，分别取2.18×101～2.18×106拷贝/μL共6个稀释度作为模板进行荧光定量PCR反应，以CT值为纵坐标、模板拷贝数为横坐标，获得标准曲线(图2-a)，回归方程为y=33.855-3.16x，r2=0.996，结果表明，其线性关系良好、相关系数较高。随机选取3个不同稀释度作为模板重复扩增3次，结果表明，每个稀释度之间的CT值误差非常小(图2-b)，变异系数均小于 0.005，表明该方法具有较高的准确性和重复性。

2.3 灵敏度比较

以不同稀释度的标准质粒为模板，分别进行常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR试验，结果表明，常规RT-PCR方法的最小检出量为2.18×104拷贝(图3-a)，荧光定量PCR方法的最小检出量为2.18×101拷贝(图3-b)，比常规方法高1 000倍。

2.4 特异性分析

分别以PRRSV、CSFV RNA反转录产物，PCV2和PRV的DNA为模板，相同条件下进行定量RT-PCR反应，结果显示：仅PRRSV基因组出现扩增曲线，其余样品检测结果均为阴性(图4-a)；随后以PRRSV反转录产物和标准质粒作为模板进行荧光PCR扩增，反应后的熔解曲线波峰单一，无引物二聚体或非特异扩增(图4-b)，说明本方法具有较好的特异性。

2.5 临床症状观察

人工接种猪于攻毒后2 d开始即出现体温升高，并于5 d左右出现呼吸困难、咳嗽等PRRS典型症状，持续至11d死亡； 同居接触后仔猪于4～5d开始体温升高，7～8d表现出相应临床症状，并分别于12、13 d全部死亡。

2.6 病毒血症检测

定期采集仔猪血清样品，利用建立的荧光定量RT-PCR方法对病毒血症进行检测，检测结果见图5。人工接种仔猪在1 d时即为PRRSV检测阳性，随后病毒载量逐渐上升，并维持较高水平，病毒载量为108.4～108.7拷贝/mL直至11 d死亡；接触感染后仔猪在3 d首次检出PRRSV，7 d内迅速升高至 108.5拷贝/mL，并稳定在较高含量，至13 d时3头仔猪全部死亡；空白对照组仔猪全部血清样品均检测为PRRSV阴性。

2.7 粪便排毒检测

定期采集试验仔猪粪样，荧光定量RT-PCR检测结果见图6。人工接种后仔猪在3 d为PRRSV检测阳性，随后病毒含量呈上升趋势并维持较高水平，病毒载量为104.5拷贝/g至 11 d 死亡；同居后感染仔猪于5 d PRRSV检测阳性，7 d排毒量迅速上升至104.0拷贝/g，并稳定在较高水平至13 d死亡；空白对照组仔猪粪便检测结果均为阴性。

3 讨论

常规RT-PCR方法检测PRRSV在动物体内动态分布时，仅能做定性或半定量分析，而荧光定量PCR(FQ-PCR)可以确定病毒在动物组织内的精确拷贝数，因此该技术已越来越多地应用于病毒定量分析的研究中[10]，另外，相比传统的TCID50法检测病毒含量，FQ-PCR方法更加快速、稳定[11]。本试验建立的PRRSV FQ-PCR检测方法灵敏度比常规RT-PCR高1 000倍，并且特异性强，和其他常见病毒无交叉反应，具有良好的重复性和稳定性，为PRRSV接触感染仔猪后的增殖动态检测提供了技术支持。

PRRSV动物感染试验不易成功，与宿主、病毒和试验环境等方面密切相关[12]。猪是PRRSV感染和出现临床症状的唯一宿主，用于PRRSV动物试验的理想模型是SPF、CDCD(cesarean-derived colostrum-deprived)猪和PRRS阴性猪[13]，前2种试验猪获取比较困难，因此，本试验首先通过RT-PCR和ELISA方法从某PRRS非免疫猪场筛选获得PRRSV抗原和抗体双阴性猪，用于感染试验，而所用PRRSV毒株为高致病代表株JXA1[14]，能够引起PRRS典型病变；另外，动物试验均在负压隔离器中进行，免受外界环境干扰。以上因素均保证了PRRSV能够通过接触传播感染仔猪。

为模拟自然状态下的PRRSV传播，本试验首先向1头易感仔猪肌肉注射和滴鼻接种PRRSV JXA1，随后将其和另外3头健康仔猪同居饲养，研究结果表明，人工接种猪于攻毒后2 d开始即出现体温升高，并于5 d左右出现呼吸困难、咳嗽等PRRS典型症状，至11 d死亡，同居接触仔猪的发病时间推迟2～3 d，并分别于12、13 d全部死亡；通过荧光定量RT-PCR对接触感染仔猪的病毒血症和粪便排毒进行动态监测，结果表明，其血清和粪便分别于3、5 d首次检测PRRSV阳性，相比人工接种猪推迟2 d左右，病毒在仔猪体内增殖动态和人工接种猪相似，感染后7 d迅速上升并维持在较高水平，说明仔猪确实死于PRRSV感染。综上所述，本试验为建立PRRSV接触感染仔猪模型奠定了基础，为高致病性PRRS新型疫苗的研发及免疫效果评价等研究提供了参考数据。

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