3D培养技术在细胞培养中的应用

窦毅鹏

摘 要：细胞培养是研究体内细胞在体外生物学行为的重要的研究手段。传统的细胞培养是在培养皿或培养瓶的二维平面上进行的，这与细胞在体内所处的三维生长环境有着很大的区别。三维（3D）培养则是一种可以使细胞在体外条件下在进行三维生长的培养方法，可以更好地模拟细胞在体内的生长状况及环境。在三维培养条件下细胞的许多生物学行为与传统的二维培养有着很大的不同，其应用领域也有更广泛的扩张，具有重要的研究意义。本文将对三维细胞培养的发展、特点及应用进行简要的综述。

关键词：3D 细胞培养 体外培养 支架技术

中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2018）01（c）-0247-02

1 3D細胞培养的发展过程

自从四十多年前常规真核细胞培养出现以来，支持细胞生长的最常见的物质为聚苯乙烯或玻璃，细胞在其平坦的二维表面可以进行生长。应用这种细胞贴壁培养的方法，已经有成千上万的关于肿瘤细胞或正常细胞生物行为的研究被发表。然而，对这些研究所基于的一个主要假设是，体外单层培养的细胞可以再现生物细胞在体内的生理学行为。显然，在二维的玻璃或聚苯乙烯底物上生长的真核细胞并不能准确地反映出自然条件下组织中细胞的生长及与细胞外基质的准确的相互作用。

已经有研究发现，在体外培养条件下所观察到的许多复杂的生物学反应如受体表达、RNA转录、细胞迁移和细胞凋亡等与在体内器官或组织中所观察到的并不相同。从正常的细胞分裂、细胞增殖到细胞迁移及细胞凋亡等细胞生物学行为都是需要依赖于空间和时间的精确调控。相比之下二维的细胞的培养方法则相对简单，忽略了这些已知的对细胞生长和组织生理学的精确调控有重要意义的参数。这其中包括机械力的信号、细胞与细胞基质之间的信号传递以及相邻细胞微环境之间的信号沟通。特别是在细胞间信号传递方面，许多二维培养实验未考虑不同细胞类型之间的相互作用，绝大多数培养物是单一细胞类型。虽然随着研究方法的发展，二维培养部分程度地克服了这些缺陷中的一些，但在准确再现组织内观察到的细胞功能方面还有一些欠缺。

针对这些问题，为了更好的模拟体内的细胞生长模式，研究者们通过各种努力，开发出了许多方法使得细胞可以在体外进行三维条件下的生长，也就是3D培养。最初的一个简单的出发点是将细胞引入多孔生物相容性支架，是细胞在支架中进行生长。然而，3D系统的复杂性随着许多参数的考虑而变得明显。其中就包括对不同材料支架的选择、细胞的来源以及实际的培养方法等，根据这些因素的不同，对于不同组织来源的细胞所进行的3D培养方法也具有很大差异。随着研究的不断深入目前已经有根据特定细胞所设计的不同的3D培养条件。并且在不同的细胞生物学行为实验中有着不同的应用。

2 3D细胞培养的分类

一般来说，三维培养可分为有支架技术和无支架技术两种。这两种培养模式在不同的研究中具有应用。

2.1 支架技术

细胞支架技术又可根据使用的支架材料的不同分为用固体支架，水凝胶和其他材料。其中水凝胶技术是应用的最为广泛的一种。因为天然的细胞外基质在细胞的存活、增殖、分化以及迁移中均扮演着重要的角色，而不同成分的水凝胶被认为是用来模拟不同天然细胞外基质的较为理想的材料。3D培养所用的水凝胶由具有高保水性的相互连接的孔组成，其中包含了各种细胞生长所需的营养素和气体。来自天然和合成材料的几种不同类型的水凝胶均可用于3D细胞培养，例如动物细胞外基质提取物水凝胶、蛋白质水凝胶、肽水凝胶、聚合物水凝胶及木基纳米纤维素水凝胶等。

处理水凝胶支架外许多其他的材料也都在被尝试用于细胞的3D培养，例如，使用天然来源或合成材料作为支架，使用自体或成体干细胞作为支架，以及使用精确的纳米结构材料作为支架，更有研究应用具有近似几何形状的微结构支架以维持细胞生长。

2.2 无支架技术

无支架技术是另一种独立于支架技术的3D细胞培养方法。无支架的培养方法包括使用低粘附细胞培养板、悬滴培养板、微图案表面和旋转生物反应器以及磁悬浮和磁性3D生物打印等。其中生物反应器是较新也较为复杂的一种培养装置。用于三维细胞培养的生物反应器是小型塑料圆柱形腔室，专门设计用于三维培养细胞。生物反应器使用生物活性合成材料，如聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，在维持高水平营养的环境中包围球状细胞。这一装置可以很容易打开和关闭，使细胞球体可以用于实验测试，但同时细胞培养的环境能够保持100%的湿度，这个湿度对于获得最佳的细胞生长状态和完整的细胞功能具有重要意义。单个的生物反应器室被组装入更大的装置中，可以使其旋转，从而确保在三个维度上的每个方向上的细胞生长状况相同。

3 3D细胞培养的应用

在活体组织中，细胞存在于三维微环境中，具有复杂的细胞-细胞和细胞-基质相互作用以及复杂的营养物质和细胞的运输动力学。常规的二维或单层细胞培养不足以代表这种环境，这往往使得它们不能作为体内药物疗效和毒性预测指标筛选的实验方法。因此3D细胞培养越来越多地被用于药物毒理学筛选。另外，3D细胞培养具有比二维细胞培养更高的稳定性和更长的寿命。在2D中，细胞必须定期进行胰蛋白酶消化，以便为细胞正常生长提供充足的营养，而3D环境还可以使细胞不受干扰地生长，三维球体已经在实验室环境中养殖长达302d，同时仍然保持健康的非癌性生长。这意味着他们更适合长期研究和证明药物的长期效应。

在研究细胞间信号传递以及细胞外基质与细胞的相互作用方面，3D球状体更接近体内组织。3D培养基质可以帮助细胞能够在其球体内移动，类似于细胞在活组织中移动的方式。因此，3D培养也是研究细胞迁移、分化以及存活和生长的理想模型。此外，三维细胞培养可以提供更精确的细胞极化描述，而在2D中，细胞只能部分极化。并且，3D培养可以实现对细胞外机械力信号传递的研究。而在细胞基因功能研究方面，在3D中生长的细胞表现出与在2D中生长的细胞不同的基因表达，在3D中生长的体外细胞的基因表达比2D更具有应用价值，因为3D球状体的基因表达将更接近于体内的基因表达。

综上所述，3D细胞培养与传统二维培养具有很多优势，是一种能够更好模拟体内环境的培养方法，并且正处在快速的方法革新过程之中。同时，这一方法的建立也需要相对复杂的条件及技术。目前，3D培养技术在肿瘤药物的研发、细胞生物学行为以及基因功能的研究方面均表现出重要的价值，因此，掌握这一方法对今后细胞生物学行为的研究具有重要的意义。

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