小反刍兽疫活疫苗二次免疫效果评价

鲁立柱，柏 庆，任国堂，汪 萍，王 延，黄 炯

(1.天康生物股份有限公司，乌鲁木齐 830000；2. 新疆畜牧科学院兽医研究所 新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，乌鲁木齐 830000)

小反刍兽疫(peste des petits ruminants, PPR)又称“羊瘟”，是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)引起羊的高度接触性传染病。PPRV可导致高达100%的发病率和90%的死亡率。山羊通常对PPRV的敏感性比绵羊高且康复率高于绵羊[1-3]。该病是OIE法定报告动物疫病，也是全球计划根除的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[4-5]。PPR活疫苗被用于预防该病，鉴于该疫苗可产生长达3年的免疫持续期以及我国成功消灭牛瘟的经验，农业部印发了《全国小反刍兽疫消灭计划(2016—2020年)》[6-7]。

为切实做好PPR消灭工作，有效保障养羊业稳定健康发展，按照《中华人民共和国动物防疫法》和《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》的要求，免疫地区的养羊场(户)应做好羊群免疫工作，对新生羔羊和新补栏的羊要及时补免，并做好免疫记录，免疫抗体合格率应达到70%以上。但在基层免疫工作中，对一些免疫背景不清、新补栏羊进行补免时，二次免疫是否会中和动物已经产生的PPR抗体从而影响免疫效果，以及对初次免疫PPR活疫苗后不产生抗体的羊进行二次免疫能否产生PPR抗体存在疑问，鉴于此开展了PPR活疫苗的二次免疫试验研究。

1 材料与方法

1.1 供试疫苗 PPR活疫苗2016011-1批，由天康生物股份有限公司生产。

1.2 主要试剂 PPR标准阳性血清、PPR标准阴性血清、PPRV Nigeria 75/1株及Vero细胞均购自中国兽医药品监察所。

1.3 试验动物筛选 试验用绵羊由昌吉兴农胜商贸有限公司提供。采集1岁龄左右健康绵羊血100份，用病毒中和试验方法[8]检测PPR中和抗体，选择PPR中和抗体效价小于1∶4 的绵羊80只用于试验。

1.4 试验分组及免疫接种 一次免疫组，绵羊30只，各颈部皮下注射PPR活疫苗1头份，监测免疫后21～323 d PPR抗体水平；二次免疫组，绵羊50只，各颈部皮下注射PPR活疫苗1头份。免疫后21 d，在另一侧颈部皮下注射PPR活疫苗1头份，监测二免后3～21 d PPR抗体水平。

1.5 免疫抗体检测 将被检羊血清及对照血清56 ℃水浴灭活30 min。在96孔细胞培养板将血清进行2倍系列稀释，向所有血清孔中加入含100 TCID50/0.1mL的PPRV，37 ℃作用1 h后向所有孔中加入浓度为2×105/mL～3×105/mL的Vero细胞悬液0.1 mL。设立病毒回归对照，即将100 TCID50/0.1mL病毒工作液用无血清MEM细胞培养液10倍系列稀释成10 TCID50/0.1mL、1 TCID50/0.1mL、0.1 TCID50/0.1mL，取病毒工作液和3个稀释度病毒液，每个病毒液接种5孔，每孔0.1 mL。置37 ℃、5% CO2中培养6 d，期间每日观察细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。

1.6 中和抗体结果判定 100 TCID50、10 TCID50病毒对照及阴性血清对照孔均应出现CPE，1 TCID50病毒对照部分孔出现CPE，0.1 TCID50病毒对照及阳性血清对照1∶160稀释度以下细胞孔和细胞对照孔应不出现CPE。记录被检血清各稀释度CPE孔数，以5个试验孔均未出现CPE的血清最高稀释度为中和抗体滴度，中和抗体滴度不小于1∶10判为阳性。

2 结 果

2.1 PPR活疫苗一次及二次免疫效果 PPR活疫苗一次免疫后21 d PPR中和抗体滴度平均可达5.18±2.87，阳性率为84%，一免后180～323 d 每个月进行一次PPR抗体检测，PPR抗体阳性率均为83%。二次免疫后3～21 d，抗体一直呈上升趋势，平均滴度分别为5.65±2.56、6.95±1.82、7.28±1.18、8.12±1.31，阳性率分别为90%、100%、100%、100%(表1)。

表1 二次免疫组PPR抗体检测结果Tab 1 PPR antibody detection results of secondary immunization group

2.2 PPR活疫苗持续期检测结果 PPR活疫苗免疫持续期可以达到3年，通过本次10个多月的检测，免疫后323 d PPR抗体滴度仍然维持在6.59±1.24(图1)，阳性率为83%。

图1 一次免疫组PPR抗体水平消长曲线图Fig 1 Dynamic curves of PPR antibody levels in primary immunization group

3 讨 论

PPR活疫苗是一种通过Vero细胞培养的弱毒活疫苗，基于对原宿主失去致病力或致病力弱但仍具有免疫保护性的Nigeria 75/1株制成。PPR活疫苗自2007年10月开始在我国应用，宋跃君、何利昆等人分别对PPR活疫苗的免疫效果进行了试验，结果证实疫苗在免疫场中应用半年后PPR抗体阳性率可达83.2%，一年后达90.3%[9-10]。虽然免疫抗体合格率达到了70%以上的要求，但由于羊个体敏感性差异及防疫人员免疫操作水平、疫苗保存条件等因素仍造成了部分羊未达到免疫保护标准。在疫病爆发时仍会造成养殖户的损失。通过对PPR活疫苗的二次免疫试验证实，一次免疫后21 d抗体阴性率为16%，二次免疫7 d后抗体阳性率为100%，说明在一次免疫中没有产生抗体的羊经二次免疫抗体合格率能达到100%，且对已经产生的PPR抗体不会产生中和抵消作用。

PPR活疫苗免疫持续期可以达到3年，通过本次10个多月的检测，免疫后323 d PPR抗体滴度仍然维持在6.59±1.24，阳性率为83%。另外，不同品种的羊对该疫苗的免疫效果也有差异，徐雅萍等对免疫PPR活疫苗的湖羊进行检测表明湖羊在免疫该疫苗后14 d免疫合格率能达到100%，7个月后免疫合格率降至88.24%[11]。因此，对免疫一段时间后部分羊PPR抗体降低的现象，还是推荐进行二次免疫。由于条件限制未对二次免疫羊群进行免疫持续期监测，但从抗体水平及阳性率考虑，其持续期应不低于一次免疫羊群。

疫苗在基层的应用中，可能遇到免疫背景不清的羊群，在不具备检测条件的情况下是否需要进行羊群免疫是基层工作者的疑虑。通过二次免疫试验证实，对已经有PPR抗体的羊进行再次免疫，羊群平均抗体水平未出现中和反应引起的抗体下降现象，相反，二免后PPR抗体阳性率明显提高至100%。因此，养殖户可根据羊群的免疫情况及疫病的爆发情况，选择是否进行疫苗二次免疫。二次免疫试验结果可对PPR疫苗的免疫防控工作提供指导，在疫病爆发时对羊群可集中免疫，同时对免疫背景不清的羊群也应当进行免疫。

参考文献：

[1] Naveen K, Sunil M , Sudhir K K ,etal. Peste des petits ruminants virus infection of small ruminants: a comprehensive review[J]. Viruses, 2014, 6(6): 2287-2327.

[2] Begum S S, Mahato G, Sharma P. Assessment of immune response to a lyophilized peste-des-petits-ruminants virus vaccine in three different breeds of goats[J]. Vet World, 2016, 9(6): 568-571.

[3] Balamurugan V, Hemadri D, Gajendragad M R,etal. Diagnosis and control of peste des petits ruminants: a comprehensive review[J]. Virus Disease, 2014, 25(1): 39-56.

[4] Satya P, Murali M, Eda A,etal. Emergence of PPR and its threat to Europe[J]. Small Rumin Res, 2016, 142: 16-21.

[5] Parida S, Muniraju M, Mahapatra M,etal. Peste des petits ruminants[J]. Vet Microbiol, 2015, 181(1/2): 90-106.

[6] 吴锦艳,尚佑军,田 宏, 等. 2007-2014年国内外小反刍兽疫流行现状及分析[J]. 中国兽医学报, 2016, (4): 687-693.

Wu J Y, Shang Y J, Tian H,etal. The epidemic situation and analysis of peste des petits ruminants in China and worldwide from 2007 to 2014[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2016, (4): 687-693.

[7] 刘永宏, 赵 丽, 曹胜波, 等. 小反刍兽疫在中国的流行趋势及应对措施[J]. 动物医学进展, 2015, 36(1): 110-113.

Liu Y H, Zhao L, Cao S B,etal. Prevelant trends and countermeasures of peste des petits ruminants in China[J]. Progress In Veterinary Medicine, 2015, 36(1): 110-113.

[8] 汪 萍, 尹传振, 柏 庆, 等. 阻断ELISA与病毒中和试验检测PPR抗体的比较分析[J]. 中国预防兽医学报, 2016, 38(8): 658-660.

Wang P, Yin C Z, Bai Q,etal. Comparison of ELISA with the virus neutralization test for detecting serum antibody to peste des petits ruminants[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2016, 38(8): 658-660.

[9] 宋跃君, 徐 玉, 张远洲, 等. 小反刍兽疫疫苗临床免疫效果试验[J]. 动物医学进展, 2016, 37(6)：77-79.

Song Y J, Xu Y, Zhang Y Z,etal. Clinical immune effect of peste des petits ruminants vaccine[J]. Progress In Veterinary Medicine, 2016, 37(6)：77-79.

[10] 何利昆, 段亚良, 谷志大, 等. 辽宁省小反刍兽疫疫苗临床免疫效果跟踪试验及抗体水平动态观察[J].现代畜牧兽医,2014,(8): 14-18.

He L K, Duan Y L, Gu Z D,etal. Immune efficacy and antibody level of Peste des petits ruminants vaccine in a immuno-logical experiment in Liaoning province[J]. Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2014, (8): 14-18.

[11] 徐娅萍, 邱寒峰, 俞乾挺, 等. 小反刍兽疫疫苗对不同日龄湖羊的免疫效果研究[J]. 中国预防兽医学报, 2016, 38(8): 646-648.

Xu, Y P, Qiu H F, Yu H T,etal. The immunization effects on the antibody induced by vaccine of peste des petits ruminants in Hu sheep at different day-old[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2016, 38(8): 646-648.