响应面法优化女贞子多酚提取工艺条件及其抑菌活性研究

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林132013）

女贞子（Ligustrum lucidum Ait）是木犀科植物女贞（Privet）的干燥成熟果实，具有良好的生物活性，如抗骨质疏松、抗衰老、抗肝炎、抗菌、提高机体免疫力等作用[1－2]。《本草从新》中记载：“女贞子甘苦涼，少阴之精，隆冬不凋。益肝肾，安五脏，强腰膝，明耳目，乌须发。补风虚，除百病”[3]。女贞子常用于临床治疗肝肾虚弱、腰膝酸软等症[4]。通过对女贞子成分的鉴定后发现，女贞子中含有红色素属花青素成分，是存在于女贞子中的一种植物多酚，易溶于极性溶剂，对光、热和盐的稳定性好[5]。植物多酚是植物中广泛存在的一种芳香族羟基衍生物的总称，具有抗氧化、抗菌、抗炎等多种功能[6－7]，因而植物多酚的提取，能为其后续深加工技术的发展提供前期基础[8]。目前关于女贞子多酚提取工艺的响应曲面法优化及抗菌研究相对较少。本试验通过响应曲面法优化女贞子多酚的提取工艺，以期完善女贞子多酚提取的基础研究，在此基础上进一步研究女贞子多酚的抗菌活性，为女贞子深加工技术研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

女贞子（产地：河北）：吉林市双翔大药房；福林－酚试剂：索莱宝公司；没食子酸：sigma公司；碳酸钠、无水乙醇（均为化学纯）：北京化工厂；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌：吉林医药学院细胞生物教研室赠送。

1.2 仪器与设备

KQ－800KDE高功率超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；5810R低速离心机：艾本德公司；722型分光光度计：上海菁华科技有限公司；N－1300V－WB旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社；CN－500A多功能粉碎机：中南制药机械厂；202－1型电热恒温鼓风干燥箱：天津泰森仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 女贞子前处理及提取

女贞子粉碎后过60目筛，烘干至恒重，分别称取2.0 g女贞子粉末置于锥形瓶中，加入适量的提取剂，封住瓶口，在不同超声波条件下提取，3 000 r/min离心10min，取上清液过滤，置于旋转蒸发仪中进行浓缩水化处理，定容，即为女贞子总多酚提取液。

1.3.2 女贞子多酚含量的测定

采用福林－酚法[9]检测提取物中多酚含量：移液枪取上清液 2 mL，加 5.8 mL 蒸馏水，0.5 mL 福林－酚试剂，混匀，5min 后，加入 2.5 mL 10%Na2CO3溶液，混匀后定容。40℃条件下避光反应1 h，在760 nm波长下测定吸光度值。以没食子酸为为标准品，绘制标准曲线，得到回归线性方程 y=0.011+5.147x（R2=0.999 1），没食子酸在 0.01 mg/mL～0.11 mg/mL 质量浓度范围内具有良好的线性关系，根据标准曲线方程求出女贞子提取液多酚的质量浓度。

1.3.3 女贞子总多酚提取率

式中：X为样品中的多酚提取率（女贞子中含有相当于没食子酸的毫克数），%；ρ为提取液样品中的多酚质量浓度，mg/mL；V为提取液定容后的体积，mL；N为稀释倍数；m为样品质量，mg。

1.3.4 女贞子多酚提取工艺优化

1.3.4.1 单因素试验

为研究不同提取因素对女贞子多酚提取率的影响，选取对多酚提取影响较大的4个条件进行研究，单因素试验设计如表1所示，固定提取条件为：液料比60 ∶1（mL/g）、提取时间 50min、提取功率 480 W、乙醇体积分数50%。

表1 单因素试验设计Table 1 Design of factors and levels of single test

1.3.4.2 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box－Behenken试验设计原理，以女贞子多酚提取率为响应值，通过响应面法进行四因素三水平的试验设计，优化超声波辅助提取女贞子多酚工艺参数。响应面分析表如表2所示。

表2 响应面因素水平设计Table 2 Design of factors and levels of response surface test

1.3.5 女贞子多酚的抑菌试验

1.3.5.1 菌悬液的制备

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌分别接种于肉汤（Luria－Bertani，LB）培养基，37℃下恒温培养24 h，连续活化培养2次，根据试验需要用无菌生理盐水稀释至适当浓度。

1.3.5.2 试管二倍梯度稀释法测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）

在无菌条件下，取13支试管编号，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌分别进行研究。从2号管开始，每管加入3 mL双蒸水，1号管加入600 μg/mL女贞子多酚提取液6 mL，吸取3 mL多酚提取液到下一管中并混匀，依次稀释，11号管吸取3 mL溶液并弃掉。每管加入LB培养基3 mL，接种0.3 mL菌液，并混匀。以3.3 mL双蒸水加3 mL LB液体培养基为阴性对照，以3 mL无菌去离子水加3 mL的LB液体培养基接种0.3 mL菌液为阳性对照，将处理好的样品放入37℃恒温培养箱中培养24 h，在600 nm处测定各样品吸光度值，当样品吸光度值接近阴性对照时，该管的多酚浓度即为MIC[10]。每个样品重复3次试验，测量结果取平均值。

1.3.5.3 滤纸片法测定女贞子多酚的抑菌作用

用打孔器制直径6 mm滤纸片若干，放入干燥培养皿中灭菌，干燥备用。制备固体LB培养基，加入0.2 mL菌悬液并涂布均匀。用镊子取干燥滤纸片分别蘸取女贞子多酚提取液、体积分数75%乙醇溶液和双蒸水，放入涂布后的平板上，浸泡乙醇溶液的滤纸片为阳性对照，浸泡双蒸水的滤纸片为阴性对照[11－12]。培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。每个样品重复3次试验，测量结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

液料比、提取时间、提取功率和乙醇体积分数对女贞子多酚提取率的影响见图1。

由图1A 可知，液料比为20 ∶1（mL/g）～60 ∶1（mL/g）时，随着溶剂用量的增加，多酚提取率显著增加。液料比为60∶1（mL/g）时，女贞子多酚基本溶出完全，增大液料比会导致多糖等物质溶出，但不能增加多酚提取率[13]。女贞子多酚的液料比控制在60∶1（mL/g）左右为宜。

由图1B可知，随着提取时间从10min增加至50min，多酚提取率随细胞酶解程度增加而不断增加。当超声提取时间延长至70min以后，多糖等其他物质溶出，提取的多酚会随着提取时间的延长而逐渐降解。女贞子多酚的提取时间控制在50min左右为宜。

由图1C可知，超声功率在160 W～640 W范围内，女贞子多酚提取率呈现逐渐上升的趋势，640 W时，多酚提取率达到最大，这可能与超声波产生的“空化效应”有关。样品超声时可使媒介粒子的速度和加速度增大，导致界面扩散层上的分子扩散加快，最终使多酚的溶出速度加快。当超声波功率超过640 W后，过高的“空化效应”会使女贞子多酚的结构遭到破坏，同时杂质溶出增加，导致女贞子多酚提取率下降[14]。因此，女贞子多酚的提取功率控制在640 W左右为宜。

由图1D可知，乙醇体积分数为30%～50%时，随着乙醇体积分数的增加，多酚提取率逐渐增加。乙醇体积分数达到50%时，多酚的提取率达到最大。在乙醇体积分数为50%～70%时，随着乙醇体积分数增加，溶液的极性不断增强，多酚的溶解度逐渐下降[14]，导致多酚的提取率也逐渐降低。因此，提取女贞子多酚时，乙醇的体积分数应控制在50%左右为宜。

2.2 Box－Behnken 试验设计与结果

利用 Design－Expert 8.0.6 软件进行数据拟合，试验设计与结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计与结果Table 3 Design and data from the Box-Behnken test

续表3 Box-Behnken试验设计与结果Continue table 3 Design and data from the Box-Behnken test

2.3 模型的建立与显著性检验

利用 Design－Expert V8.0.6 软件对数据进行多元回归拟合，得多元回归方程：

Y=6.00+0.34A+0.23B+0.12C+0.022D －0.23AB+0.22AC－0.067AD－0.49BC－0.38BD+0.18CD－0.25A2－0.27B2－0.40C2－0.25D2，方差分析显著性检验结果如表4所示。

表4 回归方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由表4可知，方程模型的显著性P＜0.000 1属极显著范围，说明该模型是有效可靠的。本次模型的失拟项 P 值为0.671 8＞0.05，不显著，说明此模型的拟合度良好。提取时间（A）和提取功率（B）对女贞子多酚提取率的影响极显著；二次项提取功率－液料比（BC）、提取功率－乙醇体积分数（BD）以及 A2、B2、C2、D2亦为极显著，提取时间－提取功率（AB）和提取时间－料液比（AC）的影响为显著。R2=0.928 4，说明该模型能解释92.84%响应值的变化，R2Adj=0.856 8，说明可信度较好，可以运用该模型分析女贞子中多酚提取率。

图2 各因素交互作用对多酚提取率影响的响应曲面图Fig.2 The effect of various factors and interaction on the extration ratio of polyphenols

2.4 响应面分析

各因素交互作用对多酚提取率影响的响应曲面图见图2。

响应面图能够形象描述回归方程，直观反映各因素与响应值之间的关系与交互作用，从而进一步优化多酚提取条件。由图2a可知，当提取功率的水平为－1时，随着提取时间的延长，多酚的提取率先上升后趋于平稳，当提取功率的水平为0时，随着提取时间的延长，多酚的提取率先上升后下降。提取功率的变化曲面与提取时间的变化曲面均陡峭，说明提取功率与提取时间对女贞子多酚的提取率影响均较显著，与方差分析结果相符；由图2b、图2f可知，当液料比一定时，女贞子多酚的提取率随提取时间或乙醇体积分数的升高，呈现先上升后下降的趋势。当提取时间或乙醇体积分数一定时，女贞子多酚的提取率呈现先上升后下降的趋势。图2c、图2d、图2e与图2a类似，当乙醇体积分数或液料比的水平为－1时，随着提取时间或提取功率的增加，女贞子多酚的提取率不断增加后逐渐趋于稳定，当乙醇体积分数或液料比的水平为0时，随着提取时间或提取功率的增加女贞子多酚的提取率呈现先上升后下降的趋势。

由 Design－Expert 8.0.6 软件得出的女贞子多酚的最优提取工艺为：提取时间69.60min、提取功率480 W、液料比 80 ∶1（mL/g）、乙醇体积分数 59.21%。在此条件下模型预测的最大提取率为6.527%。在此条件下重复3次验证试验，所得多酚提取率平均值为6.553%，与理论值6.527%非常接近，说明该模型能较好地预测实际提取率。

2.5 女贞子多酚MIC测定

MIC的测定结果见表5。

表5 MIC的测定结果Table 5 The results of MIC test

由表5可知，女贞子多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度依次为600、300、150 μg/mL。可见女贞子多酚对3种供试菌的抑菌效果依次为：枯草芽孢杆菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌。

2.6 滤纸片法测定女贞子多酚的抑菌作用

多酚抑菌活性结果见表6。

表6 多酚抑菌活性结果Table 6 The results of bacteriostasis of polyphenols

从表6可以看出，女贞子多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌直径分别为7.565、7.639、8.196 mm，600 μg/mL 女贞子多酚提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果均强于75%乙醇溶液。

3 结论

在超声波辅助提取女贞子多酚单因素试验基础上，利用响应面优化的最佳提取条件为：提取时间69.60min、提取功率 480 W、液料比 80 ∶1（mL/g）、乙醇体积分数59.21%。在此条件下女贞子多酚提取率为6.527%，与预测值相符，该方法提取女贞子多酚是准确可行的。通过对提取的多酚物质活性鉴定后发现，其能有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的增殖，该研究为女贞子活性成分的深度开发提供了理论依据。

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