阿魏酸联合脂肪间充质干细胞调节TGF-β/Smad信号转导通路对肝星状细胞凋亡的影响研究*

许希燕，王巧稚，罗 茂，余 鸿，刘广益△

(西南医科大学：1.基础医学院；2.药物研究中心，四川泸州 646000)

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内细胞外基质 (extracellular matrix,ECM)过度沉淀的一个病理过程，是肝脏对各种慢性损伤产生的一种修复反应，是多种肝病的必经阶段。肝纤维化的核心机制是肝星状细胞(hepatic satellite cells,HSCs)的活化[1-2]，所以治疗肝纤维化的关键是抑制HSCs增殖或促进其凋亡,从而抑制其分泌ECM或促进ECM降解。而在HSCs活化众多路径中，转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)是促肝脏纤维发生的最强有力细胞因子。TGF-β1主要通过TGF-β/Smad信号通路在体内进行表达，Smad蛋白介导了TGF-β1的胞内信号转导[3]。

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植是治疗肝纤维化的新方法，除了通过分化为肝细胞对肝脏进行直接修复外，还可经旁分泌途径诱导HSC凋亡。脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)为间充质干细胞的一种，具有和BMSCs相似的分化倾向和功能[4-6]。阿魏酸(Ferulic acid,FA)属酚酸类化合物，是中药川芍、当归等的主要成分之一，具有抗血小板聚集、抑制炎性反应、抗氧化等作用。有研究证实，FA可有效降低肝硬化患者门静脉压力，改善肝纤维化指标[7-9]。本研究探讨大鼠ADMSCs和FA通过抑制TGF-β/Smad信号通路对HSCs凋亡的影响，以期为肝纤维化治疗提供实验依据和新思路。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠肝星状细胞系(HSC-T6，江苏凯基生物技术股份有限公司)；SD大鼠ADMSCs[赛业(广州)生物科技有限公司]；阿魏酸钠(标准品，大连美仑生物技术有限公司)；DMEM/F-12培养基(上海Gibco公司)；胎牛血清(杭州天杭生物科技股份有限公司)；MTT粉剂(北京Solarbio公司)；DMSO(美国Sigma公司)；6孔Transwell培养板(美国Corning公司)；Annexin-V/PI凋亡染色试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；RNA逆转录试剂盒(北京TOYOBO公司)；荧光定量PCR反应试剂盒(德国QIAGEN公司)；兔抗大鼠TGF-β1、Smad2/3、Smad7、p-Smad2/3抗体(美国Santa Cruz公司)；ELISA试剂盒(北京诚林生物公司)； PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将HSCs、 ADMSCs复苏后，接种于10%FBS含双抗的DMEM/F-12培养基，置于37 ℃、5%的CO2饱和湿度培养箱中常规培养。

1.2.2实验分组 取对数生长期的ADMSCs和HSCs，以1∶5的比例分别接种于0.4 μm Tanswell半透膜、6孔板中，用10%FBS DMEM/F-12培养，待两种细胞密度达到约70%后均换为无血清培养基。将HSCs分为4组：空白组，HSCs单独培养，不加FA和ADMSCs；FA组，加FA处理HSCs；ADMSCs组加入ADMSCs，用Tanswell建立上下双层细胞共培养体系；FA+ADMSCs组，在ADMSCs与HSCs共培养体系中加入FA共同作用(实验前期用MTT法检测得FA的最适药物处理浓度为200 μg/mL)；以上4组均用无血清DMEM/F-12培养24 h。

1.2.3流式细胞仪检测HSCs的凋亡率 收集细胞后用预冷的PBS漂洗2次，加入500 μL Binding Buffer重悬，用5 μL FITC Annexin V和 5 μL PI进行染色，室温、避光反应15 min后用流式细胞仪检测各组凋亡率，重复3次。凋亡率=早期凋亡+晚期凋亡。

1.2.4RT-PCR检测HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表达 收集细胞，用Trizol提取各组细胞总RNA，核酸蛋白仪测定总RNA的浓度及纯度。按反转录试剂盒说明书操作，逆转录反应合成cDNA。以反应所得cDNA在Myi Q实时定量PCR仪上进行PCR反应。每个标本设3复孔，并重复实验3次，根据2-ΔΔCT法计算相对表达量并进行统计，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5Western blot 检测HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表达 各组细胞培养结束后用 PBS 清洗 3 遍，收集细胞提取蛋白。加入细胞裂解液裂解细胞，取总蛋白5 μg行SDS-PAGE凝胶电泳，经PVDF 膜转移，加入一抗4 ℃中孵育过夜，TBST 洗膜3次后再加入二抗孵育1 h。显影拍照，用凝胶图像处理系统对目标带进行分析。内参采用β-actin进行目的蛋白TGF-β1、p-Smad2/3和Smad7的表达分析。

2 结 果

2.1各组HSCs凋亡率 与空白组(7.46±1.26)%比较，ADMSCs组中HSCs凋亡率(9.84±1.64)%变化不明显(P>0.05)，FA组、FA+ADMSCs中HSCs的凋亡率[(16.81±1.57)、(22.22±2.31)%]均明显升高(P<0.05)。与FA组、ADMSCs组比较，FA+ADMSCs组中HSCs的凋亡率均明显升高(P<0.05)，见图1。

2.2各组HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表达 与其他3组比较， FA+ADMSCs组HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达明显下调，Smad7 mRNA表达明显上调(P<0.05)，见图2。

2.3各组HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表达 Western blot结果显示，与其他3组比较，FA+ADMSCs组HSCs的TGF-β1蛋白表达、p-Smad2/3表达明显下降，Smad7蛋白表达呈明显升高趋势(P<0.05)，见图3。

A:空白组；B:FA组；C:ADMSCs组；D:FA+ADMSCs组

图1各组HSCs流式细胞仪凋亡散点图

图2 各组HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表达

图3 各组HSCs的TGF-β1、Smad7蛋白及p-Smad2/3表达

3 讨 论

HSCs的激活与凋亡在肝纤维化的发生与逆转中起关键作用[1-3]。TGF-β1主要来源于HSCs，在抑制肝细胞再生的同时激活更多的HSCs，参与和促进肝纤维化的发生、发展进程，其主要通过TGF-β/smad信号转导通路对肝纤维化进行调控[10]。TGF-β1与胞膜表面特异受体结合后，可激活下游的Smads 蛋白信号通路，其中被激活的p-Smad2/3与胞浆的Smad4 结合形成复合体，转入胞核调节HSCs的基因表达[11-13]。

FA在肾脏和心脏疾病中具有抗纤维化作用，通过减少活性氧(ROS)和抑制脂质过氧化而具有有效的抗氧化活性，能减轻四氯化碳造成的肝纤维化损伤[14]，但是对HSC是否具有促其凋亡的作用，且通过什么路径调控仍有待探讨。本研究显示，在无血清条件下，FA能促进HSCs的凋亡及在一定程度上降低TGF-β1的表达水平，且明显抑制HSCs内Smad3 mRNA、p-Smad2/3的表达，Smad7表达水平明显升高。提示FA促HSCs凋亡、抗肝纤维化的机制在于下调TGF-β1及下游p-Smad2/3表达的同时，Smad7的表达可能以负反馈的方式上调，从而拮抗由Smad3介导TGF-β1信号转导路径。

间充质干细胞分泌的多种细胞因子、生长因子可以参与调节细胞的凋亡、增殖、炎症反应等生理过程,这些活性因子可能通过旁分泌效应抑制HSCs的增殖或诱导其凋亡[6]。已有研究发现，人来源的间充质干细胞通过TGF-β1/Smad2抑制上皮间质转换，减轻纤维沉积，从而缓解肝纤维化[15]。也有学者报道， BMSCs与HSCs共培养，能明显降低HSCs的TGF-β1基因及蛋白表达，上调Smad7基因及蛋白水平[16]。在本实验中，ADMSCs与HSCs以1∶5的比例共培养24 h，HSCs的凋亡率、TGF-β1及各种Smad表达无明显改变，可能原因在于ADMSCs的细胞数量较少或培养时间较短，不足以抑制TGF-β1/Smad信号转导通路。但当在共培养组中同时加入FA联合作用时，HSCs的p-Smad2/3、Smad3 mRNA表达均下调，Smad7表达上调。

有研究证明，FA可通过激活细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)的表达来抑制HSCs的活化[17]，ERK1/2激活可促进间充质干细胞的增殖[18-19]。这可以解释将FA加入ADMSCs与HSCs的共培养体系后，HSCs各指标变化明显。FA或能通过激活ERK1/2而促进ADMSCs增殖，甚至促进AMDSCs的旁分泌作用，进一步增强HSCs内Smad7 mRNA的负反馈性表达增加并抑制下游p-Smad2/3的表达，从而增强了AMDSCs对HSCs的促凋亡作用。这与本研究项目中的前期动物实验，脂肪干细胞联合FA移植治疗肝纤维化较单一治疗效果更好的结果相一致[20]。至于FA是通过影响AMDSCs的何种旁分泌途径来抑制TGF-β1/Smad信号转导通路促进对HSCs凋亡的，还需在今后的实验中进一步探讨。本实验已证实，FA联合AMDSCs对HSCs凋亡有协同促进作用，提示二者联合使用可能为临床上控制或逆转肝纤维化提供新的治疗方向。

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