小鼠压力过负荷心衰心肌组织中转化生子因子-β1、Ⅰ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白及瞬时受体电位香草酸亚型4通道蛋白表达

安 君 成宪武 刘旭光 安 康 王 宁 高 健 张 凯

(延边大学附属医院心脏中心，吉林 延吉 133000)

心力衰竭(HF)是多种心血管疾病进展的最终阶段，世界范围内HF发病率持续增加〔1〕,在压力过负荷引起的HF约占心衰总人数的50%左右。多种机制参与HF心肌重塑过程，但其确切机制仍不甚清楚。迄今研究结果表明，细胞外基质沉积、心肌纤维化是HF发生、发展的最重要因素〔2〕。先前的研究表明压力过负荷HF形成过程中IL-17A产生增多〔3〕，并通过上调基质金属蛋白(MMP)2/9表达参与压力过负荷HF心肌重塑。有报道转化生子因子(TGF)-β1、Ⅰ型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)〔4，5〕参与心肌纤维化，而具有压力敏感性的瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)通道具有压力敏感性特点，可被流体压力以及剪切力等多种刺激所激活后参与心肌成纤维细胞分化过程〔6〕，但这些因子在压力过负荷HF中的作用机制不甚清楚。本研究通过已建立的压力过负荷HF模型〔7〕,同步检测TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白表达，探讨上述因子蛋白在压力过负荷HF形成过程中的表达及可能的机制。

1 材料和方法

1.1实验动物和分组 实验动物选用4周龄雄性昆明系小鼠，体重20～25 g，共27只，由吉林白求恩医学院动物实验中心提供。将小鼠(27 只)，随机分为空白对照组(n=6)、假手术组(n=6)、心衰组(n=15，其中TGF-β1蛋白表达组5只、去Ⅰ型胶原蛋白表达组5只及α-SMA蛋白表达组5只)。

1.2小鼠压力过负荷HF模型制备 按文献〔8〕方法制备。假手术组的手术操作与模型制备组步骤完全相同，仅不用钽夹夹闭。部分夹闭主动脉弓10 w后在相同麻醉下通过心脏超声观察左室舒张末期直径、左室收缩末期直径、左室后壁舒张末期厚度以及射血分数判断是否形成HF，模型合格用于实验〔7〕。

1.3实验材料 兔抗TGF-β1多克隆抗体(稀释1∶800)购自美国Biovision公司，兔抗鼠I型胶原蛋白(稀释1∶1 000)、多克隆抗体购自英国AbD Serotec，鼠抗α-SMA单克隆抗体(稀释1∶1 000)购自德国Boehringer Mannheim公司，兔抗TRPV4多克隆抗体(稀释1∶800)购英国Abcam公司。β-actin(稀释1∶5 000)购自德国Sigma-Aldrich公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(稀释1∶1 000)购自武汉艾美捷科技有限公司，其余二抗(山羊抗兔，1∶1 000～1∶8 000)以及一抗稀释液等购自国内公司。

1.4TGF-β1、Ⅰ型胶原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白表达检测(Western印迹法) 分别抽提各组心脏组织的总蛋白，采用Bmdford法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。取20 μg蛋白上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)后，转膜。封闭液室温封闭60 min，相应一抗 孵育4℃过夜，TBST洗膜10 min，3次，辣根过氧化物酶标记的二抗(室温 90 min，TBST洗膜10 min，3次，加入新鲜配制HRP化学发光试剂，FcluroChem9900成像系统显影。采用Quantity one软件进行光密度分析，从β-actin或GAPDH 作内对照。

1.5统计学方法 应用 SPSS19.0 软件行单因素ANOVA分析，两组间用配对t检验。

2 结 果

2.1TGF-β1蛋白表达 小鼠压力过负荷HF发生过程中心肌组织中的TGF-β1蛋白表达与正常及假手术组比较明显增强(P<0.05)。见图1。

2.2Ⅰ型胶原蛋白蛋白表达 小鼠压力过负荷HF发生过程中心肌组织中的Ⅰ型胶原蛋白表达与正常及假手术组比较明显增强(P<0.01)。见图2。

2.3α-SMA蛋白表达 小鼠压力过负荷HF发生过程中心肌组织中的α-SMA蛋白表达与正常及假手术组比较明显增强(P<0.01)。见图3。

1，空白对照组；2；假手术组；3，压力过负荷心衰组；下图同图1 TGF-β1蛋白表达

图2 Ⅰ型胶原蛋白表达

图3 α-SMA蛋白表达

2.4TRPV4通道蛋白表达 小鼠压力过负荷HF发生过程中心肌组织中的TRPV4通道蛋白表达与正常及假手术组比较明显增强(P<0.01)。见图4。

图4 TRPV4通道蛋白表达

3 讨 论

HF的病理基础是心肌重塑，是多种常见心脏疾病向终末期心脏疾病发展的一个病理过程，是心脏功能由代偿期向失代偿期转变,进而引起HF的关键。HF发生过程中细胞外基质沉积、心肌间质纤维化是HF发生、发展的最重要病理过程〔9〕。各种细胞因子通过不同途径参与其细胞外基质沉积、心肌间质纤维化进最终导致HF。

TGF-β1作为一种多效性细胞因子，在诱导纤维化过程中起中心作用。已有报道高水平的血浆TGF-β1与中老年人心力衰竭风险增加相关〔4〕,而抑制TGF-β1可改善小鼠HF心肌重塑〔8〕。TGF-β1又可上调α-SMA mRNA 以及蛋白表达〔5〕。本研究结果表明压力过负荷HF中TGF-β1蛋白表达明显增加证明TGF-β1参与压力过负荷HF形成过程。本研究表明Ⅰ型胶原蛋白以及α-SMA蛋白表达在压力过负荷HF形成过程中增强，有报道称TGF-β1可上调α-SMA mRNA以及蛋白表达以及Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、MMP2/9等相关〔5〕。

近来具有感受压力特点的TRPV4通道与心血管的调节以及疾病的关系越来越引起人们的重视〔6〕。本研究结果表明，在压力过负荷HF过程中其TRPV4蛋白表达明显增强，提示压力过负荷HF发生时心脏压力变化引起TRPV4蛋白表达增强。有报道称阻断TRPV4 可抑制TGF-β1诱导的肺水肿、HF以及肺动脉高压的进展〔10〕。TRPV4又可通过整合来自TGF-β1信号和机械(压力)因素调节心脏成纤维细胞分化成肌成纤维细胞〔6〕。既往报道与心肌纤维化和心脏重塑具有密切关系的IL-17A通过MMP2/9参与压力过负荷HF形成过程〔3〕，而TGF-β1亦通过MMP2/9参与压力过负荷HF形成过程〔5〕。IL-17A和TGF-β1在下游信号传递中可能具有某种交织，存在某种调控关系。有报道指出，IL-17A通过TRPV4介导参与机械性痛觉过敏〔10〕，但这种调节是否也存在于过负荷HF形成过程中尚不清楚。

本次同步检测TGF-β1、 Ⅰ型胶原蛋白、α-SMA以及TRPV4通道蛋白在压力过负荷HF心肌组织中表达增强的结果，提示这些细胞因子以及与HF相关的因子如IL-17A等相互调节机制在压力过负荷HF形成过程中起重要作用，但其确切的机制尚不清楚。深入研究这些因子在细胞外基质沉积、心肌间质纤维化过程的作用，尤其在信息传导层面的调节机制将有助于揭示HF发生机制。

4 参考文献

1Seliger SL,Hong SN,Christenson RH,etal.High-Sensitive Cardiac Troponin T as an Early Biochemical Signature for Clinical and Subclinical Heart Failure:MESA (Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis)〔J〕.Circulation,2017;135(16):1494-505.

2Mehra MR,Naka Y,Uriel N,etal.A fully magnetically levitated circulatory pump for advanced heart failure〔J〕.N Engl J Med,2017;376(5):440-50.

3安 君,李永财,刘旭光,等.白介素-17A对压力过负荷心衰小鼠的影响〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(3):1046-7.

4Glazer NL,Macy EM,Lumley T,etal.Transforming growth factor beta-1 and incidence of heart failure in older adults:the Cardiovascular Health Study〔J〕.Cytokine,2012;60(2):341-5.

5Zhang F,Dang Y,Li Y,etal.Cardiac Contractility Modulation Attenuate Myocardial Fibrosis by Inhibiting TGF-α1/Smad3 Signaling Pathway in a Rabbit Model of Chronic Heart Failure〔J〕.Cell Physiol Biochem,2016;39(1):294-302.

6Adapala RK,Thoppil RJ,Luther DJ,etal.TRPV4 channels mediate cardiac fibroblast differentiation by integrating mechanical and soluble signals〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2013;54:45-52.

7安 康,刘旭光,高 健,等.微创压力超负荷小鼠心衰模型的建立〔J〕.中国胸心血管外科临床杂志2016;23(11):1099-102.

8Luo J,Gao X,Peng L,etal.Effects of hydrochlorothiazide on cardiac remodeling in a rat model of myocardial infarction-induced congestive heart failure〔J〕.Eur J Pharmacol,2011;667(1-3):314-21.

9Randhawa PK,Jaggi AS.TRPV4 channels:physiological and pathological role in cardiovascular system〔J〕.Basic Res Cardiol,2015;110(6):54.

10Segond von Banchet G,Boettger MK,König C,etal.Neuronal IL-17 receptor upregulates TRPV4 channel but not TRPV1 receptors in DRG neurons and mediates mechanical but not thermal hyperalgesia〔J〕.Mol Cell Neurosci,2013;52:152-60.