谷子显性恢复基因的AFLP分析

范秀丽

【摘 要】赤峰显性核不育谷子是在谷子中首次发现的核不育材料，该材料的育性受2对核显性基因互作控制，一对是显性核不育基因Msch，另一对是显性上位育性恢复基因Rf。两者共同存在时显性上位育性恢复基因Rf能抑制显性核不育基因Msch的表达，从而表现可育。利用已构建的不育基因Msch的上位育性恢复基因Rf的近等基因系（NILs）为材料，通过对300对AFLP引物组合进行筛选，找到了与显性上位育性恢复基因Rf紧密连锁的2个AFLP标记（E15/M52和E20/M41），与不育基因的遗传距离分别是7.0cM和12.7cM，而且位于不育基因的同一侧，标记间相距5.7cM

【关键词】谷子（Setaria italica）;显性上位育性恢复基因;AFLP标记

雄性不育性在植物界普遍存在，迄今为止，已经在600多个物种及种间杂种中发现了雄性不育，其中包括玉米、水稻、大麦、谷子、高粱、油菜、棉花等主要农作物。细胞核雄性不育（Nuclear male sterility）是由核基因控制的自然界最常见的雄性不育现象，人们已经在玉米、棉花、谷子、水稻、大豆、小麦、油菜和大白菜等许多作物上发现和诱导出这种雄性不育类型。在核不育材料中多数是由隐性基因控制的，由显性基因控制的核不育现象较少，国内外曾在棉花、莴苣、红胡麻草、马铃薯、小麦、亚麻等少数植物中发现过。谷子（Setaria italica）核基因互作型雄性不育是胡洪凯等1978年首次从澳大利亚谷×吐鲁番谷杂交后代中发现的，研究证实该材料的不育性受1对核显性基因控制，并定名为赤峰显性核不育，将该不育基因命名为Msch。进一步的研究表明，这份显性雄性不育材料具有其特殊性，表现在：①它的杂合不育株和纯合不育株的花药内有部分正常可育花粉，在北方谷子产区花药始终不开裂不散粉，自交不结实;但在特定短日照的生态条件下（如冬季在低纬度的海南三亚、通什和广东湛江等地）则花药部分开裂，能产生6.0%～10.0%的自交种子，可以获得纯合的全不育群体;②经过大量的测配，从它的姊妹系中发现了恢复源材料181-5，181-5携带的显性育性恢复基因Rf可以抑制杂交种中显性不育基因的表达，使育性恢复正常。

一、材料与方法

（一）材料

用于研究的材料有近等基因系msmsrfrf和msmsRfRf及F2的3∶1（Rf∶rfrf）群体。研究材料种植在试验田和温室，苗期（7叶）随机选取近等基因系各5株和3∶1群体300株，以单株为单位分别编号挂牌，然后按编号取单株嫩叶提取基因组总DNA。开花前各单株分别与同期播种基因型为MsMsrfrf的纯合不育系株穗套在一个袋内作测交，海南种植杂种后代的种子，通过育性来判断各单株是否含有显性基因Rf。

（二）显性育性恢复基因Rf的表型鉴定

由杂合不育株Msmsrfrf与恢复系181-5（msmsRfRf）杂交获得F1，F1自交选其不育株再用恢复系181-5回交，后代再自交。这样连续回交5代，最后获得了恢复系181-5（msmsRfRf）的近等基因系msmsrfrf。

近等基因系苗期各取5株用于DNA的提取，把含有Rf恢复基因的5个单株基因组DNA等量混合构成恢复池，把不含恢復基因的5个单株基因组DNA等量混合构成不恢池。3∶1群体是由杂合不育系（Mschmsrfrf）与恢复系181-5（msmsRfRf）杂交获得的F2群体，该F2群体2008年在中国农业科学院院内试验田种植，抽穗期随机选取300个F2单株穗与纯合不育系（MschMschrfrf）的株穗套在一个袋内作测交，同时取这300个F2单株的叶片用于DNA提取。

（三）AFLP分析

AFLP分析程序参照Zabeau和Vos发明的方法。AFLP酶切采用EcoRⅠ和MseⅠ双酶切组合。内切酶和T4连接酶购自NEB（New England Biolab）公司，接头、引物及其他试剂购自上海博亚生物技术公司，Taq DNA聚合酶购自Promega公司。选扩采用E+2/M+3和E+3/M+3引物组合。扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染显色观察。

（四）数据分析

结果记录有带计为1，无带计为0。数据处理用Mapmaker EXP Version 3.0软件进行。

二、结果与分析

（一）显性恢复基因Rf的鉴定

2008年冬天在海南种植测交种，每穗一行，收获期观察育性。如果穗行出现育性分离或全可育，表明这个穗行的父本含有抑制不育基因Msch表达的显性恢复基因Rf，若穗行全不育表明其父本不含有显性恢复基因Rf。不难看出Rf∶rfrf的理论比率为3∶1。本试验在试验田里随机选取300个单株穗与纯合不育系（MschMschrfrf）的株穗套在一个袋内作测交，共收获了241株测交种，不育株是59株。

（二）与不育基因Msch的恢复基因Rf连锁的AFLP标记

用近等基因系（msmsRfRf、msmsrfrf）DNA池对300对引物组合进行筛选，发现每个引物组合均可扩增出稳定、清晰的条带，每对引物约能扩出清晰的50条带，扩增片段长度50～1 000 bp。

三、讨论

雄性不育是杂种优势利用的基础，是实现谷子杂种优势利用最经济、有效的途径之一。谷子核基因互作型雄性不育的不育性受两对显性核基因（不育基因Msch和上位育性恢复基因Rf）互作控制，恢复基因通过显性上位作用来抑制不育基因的表达从而恢复育性，起到恢复基因的作用。这种由双显性基因互作控制的雄性核不育材料的发现为谷子杂种优势利用提供了一条全新的途经，但同时也应注意到由于谷子中的双显性基因控制的雄性不育性有它自己的特点，若将不育基因转移到不同的优良遗传背景中以及进行必要的细胞质转化，其转育工作十分艰难与缓慢。

众所周知，对于由2对显性基因控制的雄性不育的机制，有2种假说;一是核基因互作假说，一是复等位基因假说。核基因互作假说认为，不育性由2对核基因控制，显性核不育基因Ms对隐性可育基因ms为完全显性，显性抑制基因Rf对非抑制基因rf为完全显性，不育株有MsMsrfrf和Msmsrfrf 2种基因型，可育株有7种基因型（MsMsRfRf、MsMsRfrf、MsmsRfRf、MsmsRfrf、msmsRfRf、msmsRfrf和msmsrfrf）。

不育株有2种基因型MsMs和Msms，可育株有4种基因型MsfMsf、MsfMs、Msfms和msms。

通过遗传学的分离比例来确定是否是显性上位互作或是复等位基因，赤峰显性核不育谷子在遗传学上已被证明了是显性上位互作来控制的雄性不育性。为了提供更加有利、可靠的分子证据，利用谷子AFLP图谱，将不育基因Ms和上位恢复基因Rf定位于染色体上，看它们是被定为在同一位点上还是不同位点，从而来判断它们是上位互作基因还是复等位基因。

赤峰显性核不育谷子的这种双显性基因控制的雄性不育性与萍乡显性核不育水稻的育性控制有许多相似之处，可以把这2种机制合并研究，来确定植物之间这种控制育性的相同机理;也可以通过比较谷子、水稻与其他植物上双显性基因控制的不育性的遗传机制的异同点，来确定不同植物之间的不同发育特性，从而进一步完善双显性基因控制的不育性的遗传机制的理论基础，将会更有利于杂种优势的利用。

参考文献：

[1]刘秉华.作物显性雄性不育基因分类与起源的探讨[J].遗传，1993，15（6）：32-34.