柚皮苷对大鼠PCSK9-LDLR表达及血脂代谢的影响

谭 超，肖红波

(湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128)

柚皮苷是从芸香科植物柚果实中分离的黄酮类化合物，有报道柚皮苷能调节脂质代谢[1-5]，但其机理未明。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)/低密度脂蛋白受体(LDLR)通路已经成为高胆固醇血症治疗的新靶点[6-10]，所以，本试验研究柚皮苷是否可通过调节PCSK9- LDLR通路防治试验性大鼠的高脂血症。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 柚皮苷，纯度98%，上海永家生物科技有限公司产品；荧光定量PCR试剂盒，上海恪敏生物科技有限公司产品；甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白胆固醇( LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒，上海信帆生物科技有限公司产品；胆酸钠和胆固醇，国药集团试剂有限公司产品。

1.1.2 实验动物 健康雌性SD大鼠60只，雌雄各半，体重200 g～220 g，基础饲料和高脂饲料(1%胆固醇、8%猪油、0.25%胆酸钠和90.75%的基础饲料)由湖南农业大学动物医学院小动物实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 试验分组 动物试验分组：基础饲料适应喂食1周后，大鼠随机分成6组(n=10)，即正常对照组、高脂模型组、低剂量预防组、高剂量预防组、低剂量治疗组和高剂量治疗组。正常对照组喂食基础饲料，其余各组喂食高脂饲料，自由进食饮水。低、高剂量预防组每天需同时灌喂低剂量(10 mg/kg)、高剂量(30 mg/kg)柚皮苷。低、高剂量治疗组需在喂食高脂饲料1周后开始灌喂柚皮苷。5周后，颈总动脉取血分离血清测定血脂。处死大鼠，摘取肝脏分析PCSK9和LDLR的表达。

1.2.2 检测指标和方法 肝PCSK9和LDLR mRNA表达采用荧光定量PCR检测(PCSK9:forward,5′-TTGCAGCAGCTGGGAACTT-3′,reverse,5′-CCGACTGTGATGACCTCTGGA-3′; LDLR:forward,5′-AGGCTGTGGGCTCCATAGG-3′,reverse,5′-TGCGGTCCAGGGTCATCT-3′; 36B4:forward,5′-GCGACCTGGAAGTCCAACTAC-3′,reverse:5′-ATCTGCTGCATCTGCTTGG-3′)[3]；血脂(TC、TG、LDL-C和HDL-C)水平采用试剂盒(北京中生北控生物科技股份公司)和全自动生化分析仪(日本日立7170型)检测。

1.2.3 统计方法 所有数据用SPSS22.0进行分析。

2 结果

2.1 柚皮苷对大鼠肝PCSK9和LDLR mRNA表达的影响

高脂能显著增加大鼠肝PCSK9表达水平，降低LDLR表达(P<0.01)。试验结束时，4个柚皮苷处理组大鼠肝PCSK9表达水平都显著低于高脂模型组，与此同时，4个柚皮苷处理组中LDLR表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)(图1)。

2.2 柚皮苷对大鼠血脂的影响

高脂模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C都显著高于正常对照组，HDL-C显著低于正常对照组(P<0.01)，表明实验性大鼠高脂模型建立成功。4个柚皮苷处理组大鼠血清TC、TG和LDL-C水平都显著低于高脂模型组，4个柚皮苷处理组中HDL-C的水平较高脂模型组有明显升高(P<0.05或P<0.01)(表1、表2)。

A.PCSK9表达；B.LDLR表达。与对正常对照组相比，**P<0.01; 与高脂模型组相比*P<0.05,**P<0.01;1.正常对照组; 2.高脂模型组; 3.低剂预防组; 4.高剂预防组; 5.低剂治疗组; 6.高剂治疗组

A.PCSK9 expression; B.LDLR expression.Compared with control group,**P<0.01;Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01;1.Control group; 2.High lipid group; 3.Low dose preventive group; 4.High dose preventive group; 5.Low dose treated group; 6.High dose treated group

图1 肝前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)和低密度脂蛋白受体mRNA表达

注：与正常对照组相比++P<0.01；与高脂模型组相比*P<0.05,**P<0.05

Note:Compared with control group,++P<0.01；：Compared with high lipid group,*P<0.05,**P<0.05

表2 柚皮苷对大鼠血脂中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响

注：与正常对照组相比++P<0.01；与高脂模型组相比*P<0.05,**P<0.05

Note:Compared with control group,++P<0.01；：Compared with high lipid group,*P<0.05,**P<0.05

3 讨论

PCSK9也称为神经细胞凋亡调节转化酶1或原蛋白转化酶9，是枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶家族的成员。PCSK9基因突变已与一个常染色体显性遗传的家族性高TC血症和低TC血症相链接。自然发生的PCSK9基因各种功能增益突变和功能损失突变，已经分别被确定与高TC血症和低TC血症有关。这些的变异可通过提升其蛋白酶活性，减少LDLR水平从而阻碍TC摄取到细胞引起疾病；PCSK9的几个变种也被可认为可导致循环中TC水平的 显著降低[9-10]。

血浆LDL-C升高是心血管疾病的重要危险因素。血浆LDL-C水平可通过结合到LDLR吸收进细胞来控制。PCSK9的主要生理功能之一是介导LDLR的降解，控制LDLC颗粒在血液中循环的水平。当PCSK9结合LDLR的表皮生长因子样重复结构A时，可刺激LDLR的降解。LDLR水平的降低会导致LDLC代谢的减弱，这可能会导致高TC血症和血浆LDLC水平的升高。本试验的结果表明高脂血症大鼠PCSK9的表达和血浆TG和TC水平显著升高，LDLR的表达和血浆HDL-C水平显著降低。因此，PCSK9-LDLR已经成为新的调节血脂药物作用通路[11-12]。

柚皮苷天然存在于柑橘类水果中，尤其是在葡萄柚中，它与这些水果的苦味有关[1]。本试验证实了以前的结果即柚皮苷能调节脂质代谢[1]。本试验还发现柚皮苷能降低大鼠肝PCSK9表达水平，增加LDLR表达，表明柚皮苷能调节PCSK9-LDLR改善脂代谢紊乱，防治实验性大鼠的高脂血症。

参考文献:

[1] Toth P P,Patti A M,Nikolic D,et al.Bergamot reduces plasma lipids,atherogenic small dense LDL,and subclinical atherosclerosis in subjects with moderate hypercholesterolemia:A 6 months prospective study[J].Front Pharmacol,2016,6(3):299.

[2] Sacco S M,Saint C,LeBlanc P J,et al.Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring[J].Nutrients,2017,9(3):1-2.

[3] Feng T,Wang K,Liu F,et al.Structural characterization and bioavailability of ternary nanoparticles consisting of amylose,α-linoleic acid and β-lactoglobulin complexed with naringin[J].Int J Biol Macromol,2017,99(1):365-374.

[4] Wang H,Xu Y S,Wang M L,et al.Protective effect of naringin against the LPS-induced apoptosis of PC12 cells:Implications for the treatment of neurodegenerative disorders[J].Int J Mol Med,2017,39(4):819-830.

[5] Wang Y,Lu Y,Luo M,et al.Evaluation of pharmacological relaxation effect of the natural product naringin oninvitrocultured airway smooth muscle cells andinvivoovalbumin-induced asthma Balb/c mice[J].Biomed Rep,2016,5(6):715-722.

[6] Huynh K.Atherosclerosis:PCSK9 inhibition reduces cardiovascular events in high-risk patients[J].Nat Rev Cardiol,2017,14(5):251.

[7] Chalabi L,Canaud B,Cristol J P,et al.Plasma PCSK9 concentrations during the course of nondiabetic chronic kidney disease:Relationship with glomerular filtration rate and lipid metabolism[J].J Clin Lipidol,2017,11(1):87-93.

[8] Wanneh E,Luna G,Dufour R,et al.Predicting proprotein convertase subtilisin kexin type-9 loss of function mutations using plasma PCSK9 concentration[J].J Clin Lipidol,2017,11(1):55-60.

[9] Momtazi A A,Banach M,Pirro M,et al.Regulation of PCSK9 by nutraceuticals[J].Pharmacol Res,2017,120(1):157-169.

[10] Fernández-Ruiz I.Dyslipidaemia:Promising results with siRNA against PCSK9[J].Nat Rev Cardiol,2017,14(5):252.

[11] Baum S J,Toth P P,Underberg J A,et al.PCSK9 inhibitor access barriers-issues and recommendations:Improving the access process for patients,clinicians and payers[J].Clin Cardiol,2017,40(4):243-254.

[12] Liu L S,Bai X Q,Gao Y,et al.PCSK9 promotes oxLDL-induced PC12 cell apoptosis through the Bcl-2/Bax-caspase 9/3 signaling pathway[J].J Alzheimers Dis,2017,57(3):723-734.