海水浸泡对大鼠血液指标和主要脏器组织结构的影响

陈丽娜,奂剑波，史成和，袁丹凤，代 维 ，周继红，韩志海*

(1.安徽医科大学海军临床学院，海军总医院呼吸与危重症医学科，北京 100048;2.海军总医院海战伤救治研究中心，北京 100048; 3.第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室，重庆 400042)

浸泡性体温过低症指人员意外坠落低温湖水或海难等原因导致的体温过低症，又称为急性体温过低症。低温浸泡对机体各系统均产生影响，可引起血液系统、呼吸系统、循环系统、泌尿系统等损伤[1]，危害落海人员的生命健康。目前有一些学者对海水浸泡合并复合伤的病理生理和损伤机制研究[2-3]，但是单纯低温海水浸泡损伤的病理生理研究较少。本试验采用未麻醉大鼠模型，观察单纯低温海水浸泡5 h后，大鼠血常规、凝血功能、肝肾功能和心肝肾肺组织病结构的影响，为进一步深入研究海水浸泡体温过低症的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性普通级SD大鼠20只，体重210 g±20 g，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供，试验方案经过海军总医院动物伦理委员会批准。

1.1.2 仪器设备 温度记录器(iButton,型号DS1922L,Maxim/Dallas公司生产)，自制圆柱状鼠笼(高20 cm，直径6 cm)，水银温度计，光学显微镜，人工海水(广州益尔生物工程有限公司，按照比例配制成含盐为30 g/L的海水)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腹腔温度记录器的植入 大鼠腹腔注射15 g/L戊巴比妥0.4 mL/100 g，麻醉后，下腹部备皮、消毒,取剑突下右侧切开2 cm左右切口，将提前用石蜡包裹好的温度记录器放入大鼠肝脏下方，医用缝合线缝合和消毒，伤口涂抹红霉素软膏和腹腔注射青霉素，手术后持续3 d。10 d后选取腹部伤口完全愈合，活动自如体重稳定增长，饮食排便良好的大鼠备用。

1.2.2 动物分组与试验 取上述预置温度传感器的20只SD大鼠。按照随机数字编号分为正常组和低温组，每组10只。试验前大鼠禁食12 h，自由饮水，室温为21℃±0.5℃，大鼠固定在自制的圆柱状鼠笼内，直立放入海水中，鼠笼高20 cm，直径6 cm，正常组大鼠室温放置，低温组大鼠浸泡在15℃±0.5℃人工海水中，水位达胸骨上端，与上肢齐平，头露在水面以上。观察浸泡过程中大鼠的活动意识、呼吸、心率等生理指标。浸泡5 h时，腹主动脉采血，分别注入紫色、蓝色、红色真空采血管内，送到第三军医大学第三附属医院检验科进行血常规、凝血和肝肾功能的检测。腹主动脉放血后，分别剪取黄豆大小的肝脏、肾脏、心脏和肺组织，用冷生理盐水洗去血液，50 mL/L多聚甲醛溶液固定，进行常规酒精梯度脱水、石蜡包埋切片，行HE染色，制成病理切片，光镜下观察各组织病理变化[4]。取出腹腔内的温度记录器，采用专用软件读出大鼠腹腔各时间点的温度，绘制5 h内大鼠腹腔温度变化曲线。正常组大鼠处理同上。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 腹腔温度的变化

试验前，正常组和低温组大鼠的腹腔温度分别为37.25℃±0.38℃和37.01℃±0.26℃，两者无明显差异(P>0.05)。浸泡30 min时，低温组大鼠的腹腔温度明显下降，2 h下降到15.73℃±0.36℃，与正常组相比，两者有显著性差异(P<0.05)。2 h以后，低温组大鼠的腹腔温度趋于平稳，接近水温。试验期间正常组大鼠的腹腔温度变化不明显(图1)。

图1 两组大鼠腹腔温度的变化

2.2 生理状态的观察

浸泡0～30 min，低温组大鼠四肢活动增加，上下窜动，欲逃离冷水面，呼吸心率逐渐增加，肌颤增加，鼻、耳朵、四肢颜色由粉红逐渐变成白色，30 min后大鼠肢体活动下降，呼吸、心率减弱，2 h左右大鼠肌颤消失，处于半昏迷状态，对外界刺激反应迟钝，呼吸、心率微弱(表1)。浸泡5 h，大鼠活动意识消失，呼吸和心率不易察觉，对外界刺激几乎没有反应，根据大鼠经典的6级活动意识状态分级，大鼠处于Ⅵ级为昏迷状态。试验期间，正常组大鼠的活动意识、呼吸及心率变化不明显，未出现肌颤。

表1 浸泡2 h内大鼠呼吸、心率和肌颤的变化

2.3 血常规、凝血和肝肾功能的变化

与正常组相比，低温组大鼠血液中白细胞(WBC)和血小板(PLT)明显减少，红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)及中性粒细胞百分比(NEU%)增加，均存在显著统计学差异(P<0.01)；凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)及国际化标准比率(PT-INR)增加，均存在显著差异(P<0.05),纤维蛋白原(FIB)轻度降低，但没有统计学意义(P>0.05)；天门冬酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)明显增加，差异存在统计学意义(P<0.05)；血尿素(SUN)和肌酐(Scr)明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；钾离子[K+]和氯离子[Cl-]浓度轻度升高，阴离子间隙(AG)降低，但均没有显著性差异(P>0.05)，钠离子[Na+]浓度降低，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

2.4 心、肝、肾、肺组织病理学变化

剖检观察发现，低温组与正常组大鼠的心脏、肾脏、肝脏未见明显差异。光学显微镜下，正常组大鼠的心肌细胞结构正常，心肌纤维肌丝排列规整，低温组心肌细胞未见明显损伤，心肌纤维无断裂，间质无出血及炎性细胞浸润(图2)。光学显微镜显示，正常组大鼠肾组织肾小球、肾小管及间质结构正常，低温组见肾组织结构基本正常，肾小管上皮细胞结构完整，未见变性坏死，肾小球无明显损伤，间质未见炎性细胞浸润(图3)。正常组肝组织HE染色见肝细胞及肝小叶结构正常，肝窦排列整齐，低温组大鼠肝细胞结构及形态基本正常，肝窦排列尚整齐，肝小叶中央静脉及周边的肝窦明显淤血，细胞间隙有散在出血点，偶见炎性细胞渗出(图4)。

剖检观察显示,正常组肺组织颜色呈淡粉红色，表面光滑，质地较软，无明显出血及坏死。显微镜下观察到肺组织结构完整，肺泡间隔较薄，肺泡腔内未见炎症细胞浸润，少量散在红细胞。低温组，肺组织呈暗红色，质地稍硬，淤血水肿，显微镜下见肺泡间隔显著增厚，肺泡有扩张，肺泡腔内少量水肿液，肺毛细血管广泛淤血，肺间质散在性出血伴少量炎性细胞浸润(图5)。

表2 体温过低症大鼠血液临床常见指标检测结果

注：与正常组比较#P<0.05，*P<0.01。

Note :Compared with the normothermia group,#P<0.05，*P<0.01。

3 讨论

浸泡性体温过低症可导致全身各系统损伤，对各组织器官和生理功能产生影响。研究发现冷应激可导致机体血常规和各器官功能改变，虽然冷应激与浸泡性体温过低症试验均置于冷环境中，但冷应激试验中动物的核心体温并未明显下降和意识昏迷，且在低体温状态维持一段时间，两者损伤既有联系又有区别。目前浸泡性体温过低症的很多研究仍然停留在动物试验上，主要以麻醉动物为主，但前期试验发现，麻醉药物对低温浸泡大鼠的活动意识、呼吸及心率等产生明显抑制。该试验建立未麻醉大鼠模型，将大鼠放入自制鼠笼中，除了头部以外其余身体完全浸泡在海水中，保证不被淹溺，同时温度记录器可以连续记录大鼠的腹腔温度变化，温度曲线显示，15℃海水浸泡后，大鼠的腹腔温度呈断崖式下降，2 h左右下降至略高于水温的低温状态。本试验主要观察低温海水浸泡5 h后，大鼠血常规、凝血、肝肾功能及心、肝、肾、肺组织病理学的改变。

试验结果表明，低温组大鼠血液中RBC、HGB、HCT及NEU%均明显增加，主要原因为低温应激引起外周血管强烈收缩，同时血液中的成分从血管中转移到组织间隙，导致血容量减少，血液浓缩，粘滞性增加，从而引起各指标的增加。血液中PLT明显降低的可能原因为低温浸泡引起微血管内皮细胞受损，并且短暂性抑制肝脾造血功能。低温浸泡后，血液中PT、APTT及PT-INR明显增加，与低温导致凝血酶活性降低有关。Tsuei B J等人将低温、酸中毒和凝血功能紊乱称为“死亡三联症”，低温导致凝血功能障碍，凝血功能障碍加重低温的并发症。

低温组血清中AST和ALT明显升高，说明低温浸泡引起肝功能合成酶的活性改变，肝功能受到一定的损伤，病理也发现肝组织中肝窦明显淤血及间质散在出血，有文献报道较短时间低温浸泡建立的低温症模型未观察到明显肝病理学改变[5]，而本试验低温维持时间较长。低温浸泡后血清中SUN和Scr均有所升高，K+和Cl-轻度升高及Na+轻度降低，表明肾功能损伤，可能原因为低温刺激引起血管明显收缩及心脏泵血减少，机体血容量不足，不能够满足全身脏器需求，血液优先供应脑、心脏等重要脏器，肾组织因灌注不足功能受到损伤。剖检和光镜观察发现肾组织无明显损伤，说明本试验条件下，虽然肾组织结构尚正常，但其功能已经受损。同时也发现心脏剖检和病理组织学无明显改变，说明一定程度的低温，不会对心肌造成严重损伤，可能与低温维持时间及浸泡温度有关。

C.正常组; D.低温组 C.Normothermia group; D.Hypothermia group

E.正常组; F.低温组E.Normothermia group; F.Hypothermia group

A.正常组; B.低温组A.Normothermia group; B.Hypothermia group

G.正常组; H.低温组G.Normothermia group; H.Hypothermia group

低温浸泡后，大鼠肺组织的剖检和病理组织学均表现不同程度损伤。肺组织出现不同程度的出血和水肿，肺泡间隔明显增厚，出现肺出血，说明该低温浸泡条件下，对肺组织损伤较突出，可能与应激、酸中毒、凝血等综合因素有关。肺脏为空腔脏器，极易受到外界刺激因素的影响，并且低温浸泡对呼吸产生明显抑制，缺血缺氧也可引起机体产生混合型酸碱紊乱，同时低温导致的凝血功能障碍和心输出量下降，也增加肺淤血及肺栓塞的发生率，最终表现严重的肺功能损伤，严重者可直接导致呼吸骤停[6]，加重低温症患者的死亡风险。临床上也发现低温浸泡患者肺水肿和ARDS的发生率很高[7]。试验中发现浸泡性体温过低症导致机体肺组织严重损伤，但复温过程中是否会加重损伤目前仍不清楚。

本试验中海水浸泡5 h后，大鼠的各项生理指标、血常规、凝血、肝肾功能及器官组织病理学变化等基本符合重度低温症的表现。对于临床上低温症患者救治时，需要重点关注这些指标的改变，这些指标的异常与临床上低温症个案患者的损伤有很大关联性[8]，因此，该模型可以用于海水浸泡性体温过低症损伤机制的研究。本试验初步观察了机体的各种损伤，为以后从分子生物学的角度阐述低温浸泡伤的机制奠定基础，最终提高低温症患者的救治率。

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