检测尿Ⅳ型胶原的磁微粒化学发光法的建立及尿Ⅳ型胶原在膜性肾病中的临床应用

王 蕾， 陈伟琴， 徐旻一， 陈旭东

（1.上海市第八人民医院 上海市第六人民医院徐汇分院检验科，上海 200235；2.上海中医药大学附属龙华医院检验科，上海 200032）

慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）按病理分型大致可分为膜性肾病（membranous nephropathy，MN）、系膜增殖性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）及非膜性肾病（non-membranous nephropathy，N-MN）[1-2]。其中MN和MsPGN的主要病理改变为肾小球细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积聚和系膜细胞异常增殖[3]。Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen，ⅣC）是肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）和肾小球ECM的主要成分。其含量、分布和结构变化与MN等的发生、发展密切相关[4-5]。目前，判断CKD患者是否发生膜性改变的方法为肾穿刺活检，但此方法创伤性较大，因此患者难以接受。而实验室常规无创指标，如尿微量白蛋白、尿转铁蛋白及尿IgG等主要用于评估肾小球滤膜通透性的改变以及肾脏功能的改变[6]。因此需要寻找一种更好的无创性实验室指标用于MN的诊断、疗效监测及预后判断。为此，本研究建立了检测尿ⅣC的磁微粒电化学发光法，并对该方法进行了性能确认，同时探讨尿ⅣC在CKD中的临床价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年12月—2017年6月于上海中医药大学附属龙华医院及上海市第八人民医院住院且未接受糖皮质激素及免疫抑制剂治疗、有明确肾脏穿刺病理诊断的CKD患者274例，其中男150例、女124例，年龄（57.4±15.6）岁。274例CKD患者中MN患者139例、MsPGN患者90例（IgA肾病75例、局灶节段肾小球硬化15例）、N-MN患者45例。根据美国肾脏病协会（the National Kidney Foundation，NKF）2002年发布的慢性肾脏病临床实践指南中描述的CKD分期标准[7]将139例MN患者分为5期，其中CKD1期48例、CKD2期36例、CKD3期28例、CKD4期11例、CKD5期16例。选取上海市第八人民医院健康体检者83名作为正常对照组，其中男45名、女38名，年龄（55.3±13.9）岁。正常对照组性别、年龄与CKD组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 仪器与试剂

AutoLumo A2000全自动化学发光测定仪（郑州安图公司）及配套试剂（磁微粒化学发光法）。

1.3 方法

收集所有对象的晨尿样本。在原有的血清ⅣC检测试剂盒的基础上，与厂商合作，制备适用于尿ⅣC检测的标准品，浓度依次为0、5、10、20、50、100 ng/mL。由于ⅣC无国际公认的参考测量程序及参考物质，故根据GB/T21415—2008描述的方案，依据厂商建立的测量程序，并选用厂商工作校准品，对该方法的检测性能进行评价。

1.4 方法学评价

参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP5-A2[8]、EP9-A2[9]、EP6-A[10]等文件的要求以及仪器和试剂的产品技术要求进行方法学性能评价。

1.4.1 标准曲线建立 尿ⅣC标准品浓度分别为0、5、10、20、50、100 ng/mL。以标准品浓度为横坐标，相对光单位（relative light unit，RLU）为纵坐标，列出回归方程。

1.4.2 最低检测限 选择3份低值样本（1.5、2.7、6.2 ng/mL），每份样本分别测定10次，得到10个检测结果的RLU值，计算相应的尿ⅣC水平，依此得出3个水平的标准差s1、s2、s3，用线性回归法拟合曲线，延长该线与纵坐标相交于s0（空白样本的标准差）。3s0即为该方法的最低检测限。

1.4.3 精密度 将低值（2.7 ng/mL）、中值（27.3 ng/mL）、高值（241.1 ng/mL）样本批内重复检测10次，计算出批内变异系数（coefficient of variation，CV）。将低值（3.1 ng/mL）、中值（41.8 ng/mL）样本连续检测4 d，每天重复测定5次，计算批间CV。

1.4.4 线性分析 取接近线性范围上限的样本（H）及接近线性范围下限的样本（L）各1份，按不同的比例制备6个浓度梯度的样本，每份样本重复测定2次，计算均值。将均值与理论值按照最小二乘法进行拟合，计算线性相关系数。

1.4.5 回收试验 在已测得尿ⅣC水平的样本中分别加入不同量的ⅣC标准品溶液，进行回收试验。每份样本检测2次，取均值。比较检测值与理论值的差异，计算回收率。

1.4.6 最佳临界值 采用磁微粒化学发光法检测正常对照组、MN组及MsPGN组的尿ⅣC水平。分析结果并绘制受试者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC）曲线，计算约登指数，以约登指数最大时对应的尿ⅣC水平为最佳临界值。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 20.0软件进行统计分析。数据均呈偏态分布，采用中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。采用ROC曲线评估尿ⅣC对MN的诊断效能。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿ⅣC检测磁微粒化学发光法的建立及方法学评估

2.1.1 标准曲线 将浓度分别为0、5、10、20、50、100 ng/mL的标准品重复检测2次，取均值。以标准品浓度为X， RLU值为Y，进行二次拟合，绘制标准曲线。曲线拟合方程为Y=42.802X2+106 26X-10 856（r2= 0.999）。见图1。

图1 尿ⅣC检测的标准曲线

2.1.2 最低检测限 将尿ⅣC水平分别为1.5、2.7、6.2 ng/mL的标本重复测定10次，计算得s1、s2、s3分别为0.542 0、0.630 9、0.757 5 ng/mL。用线性回归法拟合曲线，方程为Y=0.043 7X+0.492，s0=0.492，计算得磁微粒化学发光法检测尿ⅣC的最低检测限为1.48 ng/mL。

2.1.3 精密度 低值（2.7 ng/mL）、中值（27.3 ng/mL）和高值（241.1 ng/mL）样本的批内CV分别为4.22%、8.16%和3.46%，符合要求（≤15%）。低值（3.1 ng/mL）、中值（41.8 ng/mL）样本的批间CV分别为18.23%、17.61%，符合要求（≤20%）。

2.1.4 线性分析 制备6个浓度梯度的样本，每份样本测定2次，计算均值并与理论值按照最小二乘法拟合，计算得磁微粒化学发光法检测尿ⅣC的线性相关系数为0.995，符合要求（r≥0.990）。见表1。

2.1.5 回收试验 平均回收率为97.0%，符合回收率在90%～110%范围内的要求。见表2。

2.1.6 尿ⅣC对MN的诊断效能评价

ROC曲线分析显示，尿ⅣC诊断MN的曲线下面积 （area under curve，AUC）为0.875[95%可信区间（confidence interval，CI） 0.837～0.913]（p＜0.001），最佳临界值为4.15 ng/mL，敏感性为79.0%，特异性为86.7%。见图2。

表1 不同浓度梯度样本的测定结果 （ng/mL）

表2 回收试验结果

图2 尿ⅣC诊断MN的ROC曲线

2.2 尿ⅣC的临床应用评价

2.2.1 不同病理类型的CKD患者尿ⅣC水平比较MN组、MsPGN组、N-MN组尿ⅣC水平均明显高于正常对照组（p＜0.01）。MN组、MsPGN组尿ⅣC水平均明显高于N-MN组（p＜0.01）。见表3。

表3 不同病理类型的CKD患者尿ⅣC水平比较[ng/mL，M（P25～P75）]

2.2.2 不同CDK分期的MN患者的尿ⅣC水平比较

MN患者CKD1期与CKD2、CKD3、CKD4期比较，尿ⅣC水平差异均有统计学意义（p＜0.01），而与CKD5期比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 不同CDK分期的MN患者尿ⅣC水平比较[ng/mL，M（P25～P75）]

3 讨论

有研究结果显示，我国MN发病数约占原发性肾小球肾炎的23.4%[11]。2016年的统计数据显示，MN在近11年内以每年13%的速度增长，成为发病率增长最快的肾小球疾病[11]。MN起病较为隐匿，易被漏诊、误诊，且较难治愈，病情复发率高，极易出现静脉血栓、感染和肾衰竭等并发症[12]。目前，临床上除肾活检外尚无更好地诊断MN的方法或指标。虽然肾活检技术为肾脏疾病的病理诊断提供了准确、可靠的依据，但其创伤性不容忽视。在MN及MsPGN患者中，往往特征性地表现为系膜细胞增殖和ECM进行性积聚[13-14]。ⅣC是构成肾小球ECM的主要成分之一，因此在MN及MsPGN患者基底膜与系膜中会出现ⅣC分泌明显增加。虽然MN及MsPGN患者血清ⅣC水平会升高，但由于血清ⅣC检测的干扰因素较多，在患肝脏疾病、心肌纤维化及肺间质纤维化等疾病时血清ⅣC水平也均可升高，故其对MN、MsPGN诊断的特异性较低。国内外相关研究结果表明，包括糖尿病肾病等在内的MN和MsPGN患者的尿ⅣC水平明显高于正常对照组[14-16]。然而，目前尚缺乏较为理想的检测尿ⅣC的方法，以酶联免疫吸附试验为检测方法的进口试剂盒价格昂贵，操作复杂，对人员的要求较高，检测结果稳定性也较差，因此绝大多数临床实验室尚未开展尿ⅣC检测。为此，有必要建立更为敏感、特异且操作简便、成本较低的检测尿ⅣC的方法。本研究建立了检测尿ⅣC的磁微粒化学发光法。性能确认实验结果表明，该方法的最低检测限为1.48 ng/mL，有良好的线性与重复性，低值、中值和高值样本的批内CV分别为4.22%、8.16%和3.46%，低值和中值样本的批间CV分别为18.23%、17.61%，正确度符合临床要求（平均回收率为97.0%）。

本研究结果还显示，MN组、MsPGN组、N-MN组尿ⅣC水平均明显高于正常对照组（p＜0.01），MN组、MsPGN组尿ⅣC水平明显高于N-MN组（p＜0.01）。由此可见，尿ⅣC对MN及MsPGN均有较高的诊断及鉴别诊断价值。将139例MN患者根据CDK分期分为5组，结果显示CKD1～3期尿ⅣC水平逐渐升高（p＜0.01），说明随着MN、MsPGN患者疾病的进展，ECM分泌增加，尿ⅣC水平逐渐升高。因此，尿ⅣC水平与MN、MsPGN的疾病进展相关。而CKD4、CKD5期患者尿ⅣC水平较CKD3期患者逐渐降低，这可能是由于终末期患者肾脏排泄障碍导致成份潴留所致。另外，CKD4、CKD5期患者一般为严重肾功能不全、肾衰竭的患者，因此部分CKD4期及所有CKD5期患者会进行肾脏透析，透析过程中部分蛋白质被滤除，这也会导致尿ⅣC水平下降。

综上所述，本研究建立了检测尿ⅣC的磁微粒电化学发光法。该方法敏感、特异、快速、准确，稳定性好，试剂价格低廉，适宜在临床实验室推广应用。临床应用结果证实尿ⅣC对MN及MsPGN患者具有较高的临床应用价值。

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