蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾生长、免疫及肌肉成分的影响

程逍妹，陈子廷，颜志波，赵培雅，王方海，李广宏

( 中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275 )

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)(俗称南美白对虾)是世界上养殖产量最大的三大对虾之一，也是中国对虾养殖的优势种类，占中国对虾养殖总产量的80%以上[1]。但是，随着养殖规模的不断扩大与集约化程度的不断提高，对虾的病害也频繁发生，导致成活率过低，给对虾养殖业造成严重经济损失。抗生素虽然能够有效预防和治疗各种疾病，但长期大量使用抗生素和化学药物必将造成环境污染、药物残留、抗药性菌株产生和对虾品质下降等一系列问题，严重影响对虾产业的健康持续发展。因此,改善对虾动物营养状况以促进对虾生长，提高对虾免疫功能和机体防御能力而达到防治疾病的目的，已成为越来越多研究工作者所关注的课题。

家蝇(Muscadomestica)幼虫(俗称蝇蛆)含有丰富的蛋白质、脂肪酸、氨基酸、几丁质、多种维生素、矿物元素以及抗菌活性物质，不仅是一种优质的动物性蛋白饲料源，也是一种新型的蛋白类免疫增强剂，在畜禽和水产养殖中具有良好的应用前景[2-3]。近年来，已研究了鲜活蝇蛆、蝇蛆粉或蝇蛆抗菌肽对凡纳滨对虾生长性能、体成分及免疫的影响。王娓等[4]以鲜蝇蛆喂养凡纳滨对虾，其有效激活了对虾酚氧化酶系统，提高了对虾抵抗病毒感染的能力。刘丽波等[5]用鲜活蝇蛆等量替代人工配合饲料养殖凡纳滨对虾,发现用25%～50%鲜活蝇蛆代替相应质量的配合饲料，对虾生长未受影响，并在一定程度上提高了对虾的免疫力。曹俊明等[6]用蝇蛆粉等氮替代20%～60%的鱼粉，凡纳滨对虾的生长性能和饲料系数与对照组差异不显著，但对虾肥满度和存活率却高于对照组。邓田芳等[7]用蝇蛆粉等氮替代凡纳滨对虾饲料中部分鱼粉，当蝇蛆粉添加量<7%时，可提高试验虾生长性能，但饵料系数差异不显著，而超过这一添加量时，生长性能下降，饵料系数提高。李志杰等[8]研究发现，用15%蝇蛆粉等氮替代鱼粉，凡纳滨对虾的生长性能极显著高于对照组。李林等[9]在饲料中添加家蝇抗菌肽提高了凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒的能力。陈冰等[10]在饲料中添加适量的家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾有一定的促生长作用，显著提高虾体的粗蛋白和灰分含量及免疫相关指标。以上研究结果说明，蝇蛆或蝇蛆粉可代替部分商品饲料或鱼粉养殖对虾；使用适量蝇蛆、蝇蛆粉或蝇蛆抗菌肽养殖凡纳滨对虾，在一定程度上可提高对虾免疫力。但是，给凡纳滨对虾直接投喂鲜蝇蛆，部分蝇蛆漂浮于水面上，长期使用易污染养殖水体；蝇蛆粉一般经高温干燥，破坏了许多活性物质，免疫调节功能大大降低甚至完全丧失；而蝇蛆抗菌肽经提取、分离和干燥等工序处理后，成本极高。鉴于此，笔者开发了一种可在常温下保存的液态蝇蛆蛋白对虾免疫增强剂，经养殖应用，效果良好。

1 材料与方法

1.1 材料

蝇蛆蛋白由江门龙源科技有限公司提供；凡纳滨对虾虾苗为活力强、饱满度好及规格整齐的一代虾苗，购自正大集团珠海种苗场；基础饲料为广东海大集团生产的“容川”牌南美白对虾配合饲料，粗蛋白含量≥40%；血清检测试剂盒由南京建成生物工程研究所生产。

1.2 方法

1.2.1 蝇蛆蛋白及蝇蛆蛋白饲料配制

将收取的蝇蛆磨成浆，浓缩，再按一定比例配以卵磷脂、壳寡糖和多种维生素等，制成蝇蛆蛋白。投喂前将蝇蛆蛋白按20%比例添加到凡纳滨对虾基础饲料中，混合均匀，室温晾干，制成蝇蛆蛋白饲料。

1.2.2 饲养管理

试验于 2013 年12月至2014年5月在江门市新会区礼乐镇4口条件相近的池塘中进行。每个池塘面积5000 m2，配备 1.75 kW 叶轮式增氧机3台。各试验池放养密度均为9.0×109尾/hm2，投苗20 d后，2口养殖池塘投喂基础饲料，剩余2口投喂20%蝇蛆蛋白+基础饲料，在8:00、14:00及18:00投喂，投饵量为对虾体质量的5%～10%。供试虾池的饲养管理一致。试验为期150 d，重复2次。

1.2.3 测定指标与方法

1.2.3.1 生长指标

试验开始(投苗后第20 d)和结束时从各试验池随机取样50尾虾，测量体质量、体长；试验结束时，测量各试验池对虾产量，计算体长增长率、相对体质量增加率、饲料系数、成活率。

体长增长率/%=[(L2-L1)/L1]×100%

相对体质量增加率/%=[(m2-m1)/m1]×100%

饲料系数=[m3/(m2-m1)]

成活率/% = (n2/n1)×100%

式中，L1为试验初始体长；L2为试验终末体长；m1为试验初始体质量；m2为试验终末体质量；m3为摄食饲料质量；n1为试验初始尾数；n2为试验末存活数。

1.2.3.2 非特异性免疫指标

试验结束时，从各试验池随机取45尾虾，用酒精棉球消毒并吸干取血部位表面水分，用1 mL的一次性无菌注射器针头平斜插入围心腔内抽取对虾血淋巴液，置2 mL的灭菌离心管中(每一管混合15尾对虾血淋巴)，4 ℃静止2 h，3000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃保存备用。用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定血清中超氧化物岐化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和溶菌酶，测定方法按照试剂盒说明书进行。血清酚氧化物酶活性的测定参考Ashida[11]的方法。

1.2.3.3 肌肉营养成分

试验结束时，从各试验池随机取样100尾，每个试验池取对虾肌肉300 g制成3份肌肉样品，每份肌肉样品100 g，用生理盐水(0.86%)洗净、吸干后，放入-80 ℃超低温冰箱冷冻保存，用于测定肌肉营养成分。

对虾肌肉主要营养成分及氨基酸组成由广东省质量监督食品检验站测定。粗蛋白采用微量凯氏定氮法(GB 5009.5—2010) 测定；粗脂肪采用索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003) 测定；水分采用105 ℃烘箱干燥法(GB 5009.3—2010) 测定；灰分采用550 ℃高温灼烧法(GB 5009.4—2010) 测定；氨基酸测定采用酸水解法(色氨酸用NaOH水解)(GB/T 5009.124—2003)测定；脂肪酸采用气相色谱法(GB/T 17377—2008)测定。

1.3 数据处理

试验数据用平均值±标准差表示，采用软件SPSS 19.0进行单因素方差分析，Duncan′s多重比较法分析试验结果的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾生长性能的影响

投喂添加有蝇蛆蛋白的饲料后，凡纳滨对虾的增长率、相对体质量增加率和存活率明显提高(表1)。试验结束时对照组的增长率为(287.80±15.6)%，相对体质量增加率为(5161.11±32.82)%，存活率为(52.89±4.22)%； 而添加蝇蛆蛋白组的体长增长率、相对体质量增加率和存活率分别达(310.51±11.39)%、(6383.33±20.54)%和(64.61±3.47)%，与对照组差异显著(P<0.05)；饲料系数则添加蝇蛆蛋白组显著低于对照组(P<0.05)。试验结果表明，在饲料中添加蝇蛆蛋白具有促进凡纳滨对虾生长及降低饲料系数的作用。

表1 凡纳滨对虾摄食添加蝇蛆蛋白饲料时的生长性能

注：同行数据后标不同英文字母的平均值间差异显著(P<0.05)，下同.

2.2 饲料中添加蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响

凡纳滨对虾血清中非特异性免疫指标测定结果见表2。与对照组相比，添加蝇蛆蛋白组对虾的超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酚氧化物酶和溶菌酶活性均显著提高(P<0.05)。

2.3 饲料中添加蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾肌肉成分的影响

饲料中添加蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾粗脂肪、灰分和水分含量影响不显著(P>0.05)，而对粗蛋白含量影响显著(P<0.05)( 表3)。

摄食添加蝇蛆蛋白的饲料时，凡纳滨对虾肌肉中氨基酸总含量、必需氨基酸总量、鲜味氨基酸总量以及必需氨基酸占总氨基酸的比值均显著高于对照组(P<0.05)(表4)。说明利用蝇蛆蛋白养殖的凡纳滨对虾不仅有效提高了虾的营养价值，同时还增加了虾的鲜度。经品尝，用蝇蛆蛋白养殖的凡纳滨对虾比普通饲料养殖的更鲜美，肉质更紧实。

表2 凡纳滨对虾摄食添加蝇蛆蛋白饲料时的非特异性免疫指标 U/mL

表3 凡纳滨对虾摄食添加蝇蛆蛋白饲料时肌肉中的主要营养成分 %

表4 凡纳滨对虾摄食添加蝇蛆蛋白饲料时肌肉氨基酸组成(干质量) %

注：*必需氨基酸，**呈味氨基酸.

3 讨 论

3.1 饲料中添加蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾生长性能的影响

无论是鲜品，还是干粉，蝇蛆的粗蛋白质含量均与鲜鱼或鱼粉相近。作为一种非常规蛋白源，蝇蛆粉具有蛋白含量高、氨基酸平衡性好、诱食性强、抗菌肽含量高等特点，是一类应用前景非常广阔的功能性动物蛋白原料，在对虾养殖上的应用也越来越受到重视。刘丽波等[5]用25%～50%鲜活蝇蛆等量替代人工配合饲料[12]；高晓云[13]在对虾人工配合饲料中分别去掉全部、50%、40%的鱼粉,再用等量鲜活蝇蛆代替，结果均不影响凡纳滨对虾的生长。研究发现，虽然采用蝇蛆粉或蝇蛆虫肽蛋白粉等氮适量替代饲料中的鱼粉，可提高凡纳滨对虾的生长性能，但更多的报道是替代后的养殖效果与完全用鱼粉的相当[6-8,15]。但在目前鲜蛆与蝇蛆粉生产成本比鲜鱼或鱼粉高的情况下，期望以鲜蛆或蝇蛆粉替代鱼粉而在凡纳滨对虾养殖中广泛应用尚难以实现，而本试验采取在基础饲料中添加蝇蛆蛋白的方式，研究了蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾生长性能的影响。结果表明，在饲料中20%添加蝇蛆蛋白，无论是终末体质量、相对体质量增加率及成活率，还是饲料系数等均优于对照组。说明采取添加的方式更能使蝇蛆蛋白体现出良好的营养与免疫作用。本研究结果与郑伟等[14,26]在中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)上的应用效果一致，说明采取添加或补充的方法有助于促进对虾生长和提高对虾成活率；而与刘丽波等[5，13]的结果不一致，推测可能与应用方法不同有关，刘丽波等[5，13]均采用鲜蛆等量替代人工配合饲料或鱼粉，由于鲜蛆蛋白质含量约为14%～15%，低于人工配合饲料或鱼粉的含量，等量替代必将因对虾摄入的蛋白数量减少而难以达到促生长的效果。蝇蛆粉或虫肽蛋白粉等氮替代鱼粉多数报道养殖效果与鱼粉相当，未体现促生长的作用，推测与蝇蛆粉中含一定比例的几丁质有关。昆虫几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1，4糖苷键聚合而成的高分子化合物，与鱼粉等氮替代时，替代饲料中的真蛋白质必然会降低而影响养殖效果。经核算，虽然在饲料中添加蝇蛆蛋白，饲料成本有一定程度增加，但养殖效率提高，养殖成本反而降低，养殖收益率明显增加。本研究仅做了添加20%蝇蛆蛋白对生长性能的影响，该添加量是否最为适宜，尚有待进一步深入研究。

3.2 饲料中添加蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾非特异性免疫的影响

对虾为无脊椎动物，没有特异性淋巴细胞，不能分泌免疫球蛋白[16]，体液免疫机制是抵抗病原菌入侵的第一道屏障[17-18]。抗微生物因子主要是血淋巴中的各种酶，包括酚氧化物酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶等，它们以不同的途径消灭异物并抵御病原体的侵袭。

酚氧化物酶是酚氧化酶原被激活后产生的一种酶类。它通过多种方式参与宿主的防御反应，包括提高调理素、促进血细胞吞噬作用、包囊作用和结节形成以及介导凝集和凝固、产生杀菌物质等[19-20]。溶菌酶主要来自血液，是一种碱性蛋白。它通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4 糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽而导致细胞壁破裂，逸出内容物，使细菌溶解，是体液免疫的主要参与者[21]。酸性磷酸酶是巨噬细胞溶酶体的标志酶，也是巨噬细胞内最有代表性的水解酶。吞噬是巨噬细胞的典型功能之一，巨噬细胞吞噬异物颗粒形成吞噬体，然后用包括酸性磷酸酶在内的溶解酶消化异物颗粒。酸性磷酸酶的活性代表着吞噬细胞清除异物的能力，即非特异性免疫能力[22]。碱性磷酸酶普遍存在于动植物体内，是一种对底物专一性要求较低的磷酸单脂水解酶和解毒系统，在碱性条件下，可使磷酸单脂水解生成乙醇和磷酸，与一些营养物质的消化吸收有关[23]。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一，可以清除体内多余的自由基，其活性高低可以反映对虾的抗应激能力[24]。以上5种酶是对虾重要的非特异性免疫酶，在对虾体液免疫和抗病过程中发挥重要作用，其酶活力的高低常被用作评价对虾免疫机能状态的重要指标。

王娓等[4]报道，鲜活蝇蛆可显著提高中国明对虾酚氧化物酶活性；陈冰等[10]报道，在饲料中添加抗菌肽可提高凡纳滨对虾血清中酚氧化酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和溶菌酶活性；仲明等[15]用蝇蛆虫肽蛋白粉饲养凡纳滨对虾，超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶活力和杀菌活力随着虫肽蛋白粉用量增加而显著增加；陈乃松等[25]和曹俊明等[6]报道用蝇蛆粉等氮替代鱼粉饲养凡纳滨对虾，虾血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶或溶菌酶活性与对照差异不显著，甚至低于对照组；刘丽波等[5]用鲜活蝇蛆等量替代人工配合饲料养殖凡纳滨对虾,发现不同替代组的酸性磷酸酶及碱性磷酸酶活性或与对照组差异不显著或低于对照组。本试验发现，在凡纳滨对虾饲料中添加20%蝇蛆蛋白后，可显著提高凡纳滨对虾血清中酚氧化物酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性，表明在基础饲料中添加20%蝇蛆蛋白有助于提高凡纳滨对虾抗病力。该试验结果与王娓等[4，10，15]的结果一致，而与曹俊明等[6，25]不一致，推测蝇蛆粉不能提高免疫酶的活性可能与高温干燥有关，而与刘丽波等[5]的结果不同，可能与其用鲜活蝇蛆等量替代人工配合饲料导致对虾摄食的蛋白质总量下降有关。

3.3 饲料中添加蝇蛆蛋白对凡纳滨对虾肌肉成分的影响

覃志彪等[27]在凡纳滨对虾饲料中添加抗菌肽可提高对虾粗蛋白含量，降低粗脂肪含量，对水分与灰分含量无显著影响；严晶等[28]采用等蛋白替代的方式，以家蝇蛆粉分别替代饲料中0、20%、40%、60%、80%和100%的鱼粉饲养凡纳滨对虾，结果表明，凡纳滨对虾肌肉粗蛋白和灰分含量随家蝇蛆粉替代水平的增加而升高，其中100%替代组的粗蛋白显著高于对照组，灰分80%和100%替代组显著高于对照组，粗脂肪和水分各组差异不显著。本试验也证明，在饲料中添加蝇蛆蛋白可显著提高对虾粗蛋白含量，但对粗脂肪、灰分及水分影响不显著。

肌肉氨基酸组成和含量是肌肉品质研究的一项重要内容，肉质的鲜美在一定程度上取决于呈味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸)含量，其中天冬氨酸和谷氨酸是呈鲜味的特征性氨基酸，甘氨酸和丙氨酸是呈甘味的特征性氨基酸。肌肉中高含量的呈味氨基酸和必需氨基酸能提高鱼肉风味和肉质[29]。郑伟等[14]利用鲜蝇蛆养殖中国明对虾，对虾肌肉水解氨基酸的总量及其中的必需氨基酸、呈味氨基酸含量增加，必需脂肪酸含量显著低于对照组，多不饱和脂肪酸则显著高于对照组；严晶等[28]用家蝇粉等蛋白替代鱼粉，养殖的凡纳滨对虾游离必需氨基酸除个别组外，其余各组均显著高于对照组，总游离氨基酸也均高于对照组，各组结合氨基酸中的必需氨基酸差异不显著，总氨基酸处理组均高于对照组，其中80%替代组与对照组差异显著，呈鲜味氨基酸无论是游离或结合氨基酸均与对照组差异不显著。本研究用添加蝇蛆蛋白的饲料养殖凡纳滨对虾，其肌肉氨基酸总量、必需氨基酸总量、呈味氨基酸总量以及必需氨基酸占总氨基酸的比值均显著高于对照组；呈鲜味氨基酸天冬氨酸和谷氨酸在投喂蝇蛆蛋白的对虾中含量显著高于对照组，但呈甘味氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)则与对照组差异不显著。本研究结果与郑伟等[14]较一致，而与严晶等[28]不同，推测用鲜蝇蛆或本研究所使用的未变性蝇蛆蛋白，可能会更有效改善对虾的品质。试验证明，利用蝇蛆蛋白养殖凡纳滨对虾可有效提高虾的营养价值，显著增加虾肉鲜味，该结果与蝇蛆蛋白在鸡上的应用效果相似[30]。

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