我国嗜尸性蝇类分子鉴定的研究现状与分析

赵琳琳，翟仙敦，郑 哲，李永林，莫耀南

（河南科技大学 法医学院，河南 洛阳 471003）

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断 是法医学研究的热点和难点。昆虫学方法经过科研工作者的不断研究和基层法医的实践，被认为是推断死亡时间的一种有效方法。法医昆虫学的研究对象是与尸体有关的昆虫，即嗜尸性昆虫，其中与尸体关系最为密切的是鞘翅目和双翅目昆虫。双翅目中的丽蝇科、麻蝇科、蚤蝇科、花蝇科、蝇科，以及鞘翅目中的埋葬甲科、隐翅虫科、皮蠹科与郭公甲科最为重要。相对于嗅觉灵敏且能长途飞行的蝇类，甲虫通常侵袭尸体稍晚。并且嗜尸性甲虫全球性甚至全国性分布的种属较少，仅有大隐翅虫（Creophilus maxillosus）、白腹皮蠹（Dermestes maculatus）、钩纹皮蠹（Dermestes ater）以及赤足腐郭公（Neccrobiarufipes）等少数几种[1]。 因此，相比较而言，双翅目中的蝇类是研究和实际应用最多的类型。

1 嗜尸性蝇类用于推断PMI的瓶颈

利用昆虫学知识进行法医学死亡时间推断，最关键是要对嗜尸性蝇类种属做出准确鉴定。但在尸体及其附近发现的各发育阶段的蝇类，仅用形态学方法鉴定其种属往往比较困难。究其原因[2]：首先昆虫种类繁多，并且包含许多形态特征极其相近的近似种、近缘种以及种以下的亚种、生物型和地理种群，仅有少数形态学家能对其熟悉科目的种类进行物种鉴定；其二，蝇类卵、幼虫等形态差异较小，鉴别极难，如带回实验室饲养到具有足够形态特征来鉴别的成虫，将耗费大量的时间而影响案件的侦破，并且还要承担孵化失败的风险；其三，很多情况下案发现场只能采集到形态不完整的成虫、蛹壳，形态特征缺失，使形态学鉴定更加困难。嗜尸性蝇类的推广应用存在着许多障碍，严重降低了嗜尸性蝇类在实际案例应用中的价值，很大程度上阻滞了法医昆虫学的发展。因此，广大法医科研工作者都在努力寻找新的方法解决这一难题。

2 分子生物学鉴定

分子生物学的快速发展给嗜尸性蝇类的种属鉴定提供了新的契机，近20年世界范围的相关研究一直呈现上升趋势（图1），它能够在基因水平上对物种进行快速有效的鉴别，同时还可以探讨昆虫的系统发育学特点。由于生物DNA不受发育阶段的影响，终生不变，并且分子生物学方法对样本保存条件要求较低，单个翅膀或足就能提取到足够的DNA。鉴于以上特点嗜尸性蝇类的分子鉴定成为其形态学鉴定的重要方法补充。科研工作者采用多种方法对多个地区和蝇种进行了广泛而深入的研究。

2.1 DNA序列分析是分子鉴定的主要方法

嗜尸性蝇类分子鉴定所用的方法主要有：限制性内切酶片段长度多态性（Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，ALFP）、随机扩增多态性DNA标记（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、简单重复序列多态性（Inter-simple SequenceRepeat， ISSR）、序列特意扩增区域（Sequence Characterized Amplified Region，SCAR）以及 DNA 序列分析（DNA sequence analysis）等[3]。 但由于方法本身的限制，如RFLP由于受酶切位点的限制、RAPD受遗传方式和引物的限制、ALFP引物需要使用同位素和非同位素标记等，目前应用最多的是DNA序列分析，与其他方法相比更加直观，唯一的缺点就是测序成本较高，但随着测序技术的普及和新一代测序（next-generation sequencing，NGS）的发展，这一方法必将得到广泛应用。

图1 近20年世界范围嗜尸性蝇类（A）及其分子鉴定（B）研究趋势

我国学者采用该方法进行了许多研究，刘钦来[2]、蔡继峰[4]、应斌武[5]、白鹏[6]、陈凤磊等[7]、李进华等[8]、王兴华[9]、郭亚东[10]、汤振楚等[11]、熊枫[12]、Sanaa等[13]对全国多个地区的蝇科、丽蝇科、麻蝇科等的多个蝇种，王江峰等[14]、杨静波等[15]对广东、河南、四川、陕西的蝇科和丽蝇科9个蝇种，陈庆等[16]对北京的7个优势蝇种，法娜[17]对浙江华家池丽蝇科的7个蝇种，张红玲等[18-19]对贵阳丽蝇科、麻蝇科、蝇科、花蝇科4科11属19个蝇种，王剑峰等[20]对辽宁省、广东省的蚤蝇科的4个蝇种，李学博等[21]对重庆丽蝇科、麻蝇科的7个蝇种，吴荣全等[22]对福建省丽蝇科、麻蝇科、花蝇科、蝇科的15个蝇种，赵琳琳等[23]，赵祖亮[24]对河南洛阳、郑州地区蝇科、丽蝇科、麻蝇科的多个蝇种进行了研究。所采用的分子标记所在的基因有：线粒体基因组的COI，COII，16S rRNA，CYTB，ND1，ND5 基因和核基因组的 ITS1，ITS2 基因，分子标记信息见表1。但不同学者所采用的分子标记在基因上的位置有所不同。

2.2 我国嗜尸性蝇类分子鉴定地区和蝇种统计

根据国内嗜尸性蝇类分子鉴定研究和记录进行统计，共有29个省（包括省、自治区、直辖市、不包括香港和澳门），包含丽蝇科（19个），蝇科（10个），麻蝇科（12 个），花蝇科（1 个），蚤蝇科（4 个）共46个蝇种。总体来说，南方地区研究较北方多，而丝光绿蝇、大头金蝇和棕尾别麻蝇被多地区分子鉴定研究，具体结果见图2。

图2 我国嗜尸性蝇类分子鉴定地区和蝇种统计

3 研究现状及分析

我国地域辽阔，经纬跨度大，气候类型多样，很多地区（王江峰，珠江三角洲[35]；陈禄仕，贵州[36]；李玲，哈尔滨[37]；马玉堃，杭州等）已经在嗜尸性蝇类的生长发育和群落演替规律方面开展了较多研究，但由于地理位置、环境温度、营养状况等自然条件对蝇类的卵、幼虫、蛹的发育的影响较大，并且蝇类种类繁多，不同蝇种间的卵、幼虫、蛹形态差异很小，还存在一些形态特征极其相近的近似种、近缘种以及种以下的亚种、生物型和地理种群，有时同一蝇种的不同地理种群间也存在明显差异，这些都对明确蝇类发育资料和形态学分类带来困难。另外各实验室均是单独研究，没有相对统一的科学标准，研究结果的科学性难以保证。尽管我国学者已经用分子生物学方法针对蝇类的种属鉴定展开了较多研究，但所采用的分子标记多不相同，即使所在基因相同，在基因上的位置（包括长度）也不相同（表1），并且大多是针对单一地区的某几个蝇种的几只样本，没有在全国范围内统一进行。

表1 我国用于嗜尸性蝇类分子鉴定的分子标记

很多学者针对不同长度分子标记进行过研究，如COI+COII全序列或线粒体全基因组分析，但序列长度过长，对提取的DNA质量要求较高，蝇类样本保存条件亦是，同时需要多对引物扩增，测序结果需要拼接，容易产生错误，并且成本较高、对实验人员要求严格，不利于推广。陈庆等[16]采用COI中1120bp基因序列对北京地区红头丽蝇、大头金蝇、丝光绿蝇、肥须亚麻蝇、急钩亚麻蝇、棕尾别麻蝇、家蝇共7个优势蝇种进行分子鉴定，并且用与蔡继峰[4]COI基因278bp序列中重合的186bp序列构建UPGMA系统发育树，得到了相同的分支模式。但在使用全序列或部分序列构建的系统发育树中，同一物种个体序列聚集的同时也有部分物种整体出现在和分类学结果不一致的位置。刘钦来[2]采用272bp和278bp COI片段成功鉴定了70多只嗜尸性丽蝇，其中包括一些难以区分的姐妹物种，如丝光绿蝇和铜绿蝇，亮绿蝇和叉叶绿蝇等，种类鉴别能力值得肯定，但这两个片段在NJ系统进化树上对于属以上高阶元的分类系统与形态学结果有一定出入。这可能与短片段序列所含信息太少有关。关于哪个或哪些基因的哪个片段包含足够的信息用于蝇类的分子鉴定，尚需要进一步的研究和实践。

此外，根据Wells等[25]学者的研究表明，判定一个遗传标记是否能够进行嗜尸性蝇类的分子鉴定，起决定作用的是种内序列变异的百分比，且与种间序列变异百分比无重叠。联合线粒体基因COI+II进行鉴定，种内差异＜1%，种间差异≥3%，通过分子鉴定，即使不能够准确确定某一特定嗜尸性蝇种，至少可以把未知蝇种定位于某一特定的进化分支上。因此判断样本是否同种标准不应该局限在种内差异＜1%，种间差异≥3%，而应是蝇种是否位于某一特定的进化分支上，并且种内种间变异百分比无重叠。

4 展望

应用嗜尸性蝇类推断PMI是法医学的重要手段，全国范围内没有统一的嗜尸性蝇类生长发育和群落演替规律可循，所以每个地区都有必要开展独立研究，并建立当地嗜尸性蝇类生长发育和群落演替数据库，与此同时开展全国各地区嗜尸性蝇类种属的分子鉴定研究，建立分子鉴定数据库。但以上各项也必须统一进行，建立国家标准以保证研究结果的科学性和实用性。此外对于近缘种的判定还需要更多遗传标记的开发和联合应用。

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