高效液相色谱法测定花生酱中黄曲霉毒素B1结果不确定度的评定

肖利龙XIAO Li-long 花 锦

(1. 太原学院，山西 太原 030032；2. 山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山西 太原 030032)

黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一类具有类似化学结构，由黄曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (A.parasiticus) 产生的强毒性和强致癌性的次生代谢产物组成[1]，主要成分有B1、B2、G1和G2。环境潮湿的地区存放食品和饲料中容易滋生黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1，被世界卫生组织划定为1类致癌物，其毒性是砒霜的68倍，对肝脏组织的破坏性极强，经常会在花生、玉米及其制品中检出[2]。黄曲霉毒素对人及动物肝脏组织有很严重的破坏作用会导致肝癌或死亡。黄曲霉毒素B1经常被报道污染食品，其他3类物质少见报道[3]。因此，许多国家规定了黄曲霉毒素在食品中的限量值。中国GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》明确规定花生中黄曲霉毒素B1不得高于20 μg/kg。

目前研究各类食品检测方法的不确定度评定报道很多[4-6]，黄曲霉毒素B1的不确定度评估也有相关研究[7-8]，但在花生酱中的黄曲霉毒素B1的检测方法不确定度评估尚未见，在日常检测过程中，发现花生酱中黄曲霉毒素B1检出不合格率较高。

为了评估方法的不确定度，保证检验结果评定的准确性、可靠性，提供真实、有效的依据。根据GB 5009.22—2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》的试验方法，对本实验室测定花生酱中黄曲霉毒素B1结果的测量不确定进行评定。评定从两个方面进行：方法重复性的不确定度和方法数学模型中涉及的各个分量的不确定度。以期为测量结果提供科学、准确的理论依据，同时为其他农产品中黄曲霉毒素B1不确定度的评定提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

花生酱：山西省食品药品监督管理局监督抽检样品；

黄曲霉毒素B1标准溶液：1 mg/L，中国计量科学研究院；

乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；

氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、盐酸、吐温-20：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

高效液相色谱仪：Waters2695型，配有FLD检测器，美国Waters公司；

电子分析天平：ME204E型，瑞士Mettler公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制 准确移取黄曲霉毒素B1标准溶液1 mL 于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 μg/L黄曲霉毒素B1标准储备溶液。吸取1 mL黄曲霉毒素B1标准储备溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容制成标准中间溶液。再分别移取1，2，5，8，10 mL黄曲霉毒素B1标准中间溶液于10 mL容量瓶中，用水定容制成标准工作溶液。

1.2.2 样品制备 准确称取10 g花生酱样品于250 mL三角瓶中，加甲醇-水(体积比70∶30)100 mL，均质提取5 min，提取液取15 mL再加入15 mL水稀释，待净化。

取1.2.2中获得的待净化液10 mL过免疫亲和柱，再用20 mL水进行淋洗，最后用1 mL甲醇洗脱，洗脱液经0.45 μm 有机系滤膜过滤上机。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Agela C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱温：35 ℃；流动相：甲醇∶水=50∶50(体积比)；流速：1 mL/min；激发波长：365 nm；检测波长：436 nm；进样体积：20 μL。

1.3 被测量的数学模型

(1)

式中：

X——试样中AFB1的含量，μg/kg；

ρ——进样溶液中AFB1按照外标法在标准曲线中对应的浓度，ng/mL；

V1——试样提取液体积(植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积；酱油、醋按定容总体积)，mL；

V3——样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积，mL；

V2——用于免疫亲和柱的分取样品体积，mL；

1 000——换算系数；

m——试样的称样量，g。

2 分析和量化不确定度分量

高效液相色谱法测定花生酱中AFB1需经过提取、净化、等步骤，每个步骤都可能引入不确定度(图1)。要对每个步骤都确定其不确定度的量是相对困难的，最常见的方法是选择检测方法评价中的数据进行评价，对各分量进行统一评定。

图1 花生酱中AFB1测定不确定度来源因果图Figure 1 Uncertainty source of determination for AFB1 in peanut butter

不确定有多种不同来源，其中有部分随机性误差可以通过重复测量排除，用统计方式评定，是为A类评定；但是也有许多其他不确定度的来源，例如仪器本身的不确定度，不能用重复测量和统计方式评定，要用B类评定方法，本方法中除标准物质纯度引入的不确定度为B类评定，其余分量的不确定度均采用A类评定。

2.1 质量的不确定度

由检定证书查得，该电子天平在0≤m≤100 g范围示值误差为±0.000 1 g，实际称取样品10.068 5 g，按照均匀分布，称量引入的相对标准不确定度为：

2.2 体积的不确定度

本方法体积的不确定度主要来源于校准和温度。

2.2.1 校准 本方法实际定容体积为1.0 mL，定容体积的准确与否直接影响着最终的结果。用移液枪获得该体积，按照JJG 646—2006《移液器检定规程》，A级1 mL的移液枪最大允许差为0.01 mL，按三角分布处理，由此引入的标准不确定度为：

2.2.2 温度 实验室的温度在(20±2) ℃变化，水的膨胀系数是2.1×10-4，按照均匀分布，温度差异引入的相对标准不确定度为：

2.2.3 体积不确定度的合成

(2)

计算得到：urel(V)=0.000 59%。

2.3 标准工作溶液引入的不确定度

2.3.1 标准物质纯度引入的不确定度 本检测方法所购买的标准物质来自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度为(99.0±1.0)%，从标准物质证书上查得其标准不确定度为：urel(P)=0.025%。

2.3.2 标准工作液配制过程引入的不确定度 使用经过计量校准的分量为0.1 mg的天平上称取标准品，使用A级100 mL 的容量瓶进行配制，在稀释过程中，100 mL的容量瓶、1 mL量程的移液枪分别使用2次。

根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》，查得所使用的A级100 mL容量瓶和1 mL量程移液枪的最大允许差分别为±0.10 mL和±0.008 mL，因此由容量瓶和移液枪引入的不确定度分别为：

稀释操作时，在相同的温度下使用移液枪和容量瓶，因此可忽略温度对不确定度的影响。

2.3.3 标准曲线拟合引入的不确定度 配制质量浓度为1，2，5，8，10 ng/mL的5个校准标准溶液，通过高效液相色谱仪计算得出该标准曲线方程为y=0.103 8x+0.012 5，计算得到标准曲线的不确定度仅与仪器的响应值高度有关。黄曲霉毒素校准溶液测定结果见表1。

黄曲霉毒素B1校准曲线引入的不确定度：

表1 黄曲霉毒素校准溶液测定结果†Table 1 Result of determination for AFB1 calibration solution

†p=5，N=6，c均=5 ng/mL，c0=0，b=0.103 8。

2.3.4 标准工作液浓度不确定度的合成

urel(cs)=

(3)

经计算标准工作液浓度合成不确定度urel(cs)=0.033%。

2.4 进样体积引入的不确定度

数学模型中虽然并没有涉及进样量，但在计算结果中使用了进样量。进样量的变动可以包含在重复性考虑中。在实际的检测过程中采用同一进样器采样定量环等体积进样，进入仪器的标准工作溶液和样品时温度是固定的，因此温度带入的不确定度影响可以忽略，进样体积引入的不确定度也可以忽略。

2.5 样品前处理过程引入的不确定度

对本方法进行正确度试验，选择1个空白样品进行6次加标回收试验，回收率测定结果分别为88.1%，89.2%，87.8%，94.3%，92.7%，89.9%，得到平均回收率frec为90.3%，则由样品前处理过程引入的相对标准不确定度为：

(4)

(5)

计算得出Sfrec=0.038 6，urel(frec)=1.05%。

2.6 测量重复性的不确定度

在上述试验条件下，对某阳性样品进行了6次重复测定，测得黄曲霉毒素含量分别是24.35，25.46，25.63，25.78，24.37，25.12 μg/kg，平均值为25.12 μg/kg，则由样品重复性引入的相对标准不确度为：

(6)

(7)

2.7 合成不确定度

方法重复性引入的不确定度、数学模型中各分量引入的合成不确定度：

Urel(X)=

(8)

通过计算得出：Urel(X)=1.051%。

2.8 扩展不确定度

按照包含因子k=2(置信水平 95%)，计算得出花生酱中黄曲霉毒素B1液相色谱检测法的相对扩展不确定度：Urel=k×Urel(X)=2×1.051%=2.102%。

扩展不确定度：U=25.12×2.102%=0.528 μg/kg。

3 测量结果及其不确定度的报告

用高效液相色谱法测定花生酱中黄曲霉毒素B1含量，测定结果可表示为：X=(25.12±0.528) μg/kg，k=2。

4 结论

方法的重复性或再现性只能评价n次试验结果，不确定

度包含着与测试相关的各个因素(方法、设备、环境等等)的广泛信息，说明检测质量和检测过程，再现性属于不确定度评估的一部分。本文对花生酱中黄曲霉B1的检测过程进行了不确定度分析，发现影响检测结果的不确定因素(天平称量、前处理的过程、标准溶液的配制过程及浓度、样品溶液定容体积、重复性)。对于这些不确定度的影响，可以通过调整仪器的性能、增加标准溶液的浓度点、优化前处理净化过程等方法，降低以上不确定度分量在实际检测样品中的不确定度占比，提高测量结果的可信度。

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