不同精粗比日粮对山羊瘤胃、瓣胃上皮生长的差异性研究

卢劲晔，赵怀宝，顾蓓蓓，冯 晴，张 磊，许 君，沈赞明*

（1.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；3.连云港东海县动物卫生监督所，江苏 连云港 222300）

反刍动物的胃是复胃，由4个胃室组成，分别是瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。其中，瘤胃与瓣胃为反刍动物主要的消化吸收场所。日粮添加精料比率对反刍动物前胃的生长发育起到重要的作用。在山羊与牛的研究中发现，与单纯饲喂粗料日粮相比，添加精料饲喂可以提高瘤胃重量，促进瘤胃乳头发育，增大瘤胃乳头横切面积[1-3]。大多数研究主要集中在瘤胃，研究表明高精料日粮提高瘤胃VFA含量，促进瘤胃上皮生长发育。然而，关于日粮营养对瓣胃生长影响的研究较少。本实验室前期研究发现，提高精料饲喂比率后，瘤胃重量提高，而瓣胃重量下降[4]。本试验拟进一步探索不同精粗比日粮引起山羊瘤胃、瓣胃上皮生长差异的机理。

1 试验设计

1.1 动物饲养

本试验动物选用健康的青年波杂山羊（90～120日龄）16只。试验开始前适应2周时间，期间对山羊进行驱虫，山羊自由采食及饮水，逐渐增加精料饲喂量至400 g·d-1。试验开始后，根据体重相近及公母对半原则，随机分为粗料组（PS组，n=8）和粗料+精料组（PSC组，n=8）。试验期间自由饮水及采食花生杆；PSC组每天饲喂精料400 g，饲喂持续42 d，第43天屠宰取样，日粮营养水平见表1。

表1 日粮营养水平 DM

1.2 样品采集

山羊屠宰后取瘤胃、瓣胃上皮，用预冷的PBS（pH 7.4）反复冲洗，再用吸水纸擦干，部分样品用10%福尔马林溶液固定，部分样品置于液氮保存。

1.3 上皮组织形态学观察

1.3.1 上皮组织切片制作

采用石蜡切片法观察瘤胃与瓣胃上皮组织形态。10%福尔马林溶液固定24 h后，采用梯度酒精脱水，再将组织投入二甲苯中透明10～15 min，60℃石蜡包埋。冷却后的蜡块经修块后再用切片机切片，切片厚度5 μm。采用H.E染色法染色。

1.3.2 上皮细胞形态学分析

每只山羊的瘤胃及瓣胃样品均取3个蜡块，每个蜡块精选3张非连续切片，每张切片分别读取3个不同区域，再取平均值。采用Image-Pro Plus 8.0分析系统读数上皮细胞层数。

1.4 上皮细胞细胞周期检测

1.4.1 上皮细胞的分离与固定

取出山羊瘤胃及瓣胃上皮组织，清洗干净后，剪取组织块（约500 mg）置于烧杯中，D-Hanks溶液漂洗3～4次；再加入胰酶37℃水浴消化；30 min后弃去上清液，再取出上皮组织。重复上述消化步骤3～4次。将处理后的上皮组织置于另1个干净烧杯中，继续加入胰酶消化10～15 min，显微镜镜下观察所得细胞大部分为圆形时进行收集，收集液中加入1滴小牛血清以终止消化。收集液1 500 r·min-1离心10 min后得细胞沉淀，再用PBS洗涤细胞沉淀，加入2 mL预冷的75%酒精重悬细胞，混匀后4℃保存待测。

1.4.2 碘化丙啶染色与流式细胞分析

将75%酒精固定的上皮细胞1 500 r·min-1离心10 min。细胞沉淀用PBS 50 μL重悬，再加入碘化丙啶染液500 μL，震荡混匀后置于室温避光染色20 min，再用流式细胞仪检测细胞周期。每个样品计数10 000～12 000个细胞，用ModFit软件分析结果。

2 试验结果

2.1 山羊瘤胃与瓣胃重量

山羊瘤胃与瓣胃重量见表2。

由表2可知，PSC组山羊瘤胃干重显著高于PS组（P＜0.05）；相反，PSC组瓣胃干重显著低于PS组（P＜0.05）。结果表明添加精料饲喂促进山羊瘤胃生长，却抑制瓣胃生长。

表2 不同精粗比日粮对山羊瘤胃、瓣胃重量的影响

2.2 瘤胃与瓣胃组织形态学观察

瘤胃上皮组织形态学变化如图1所示。从黏膜面向浆膜面分为角质层（SC）、颗粒层（SG）、棘突层（SS）和基底层（SB）。角质层由多层角质化细胞构成，细胞呈扁平状，细胞核及细胞器完全退化，细胞染色较深；颗粒层细胞细胞呈梭形，细胞核呈椭圆形，染色较浅；棘突层细胞较大，细胞核呈圆形；基底层又称为生发层，由1～2层立方形细胞排列而成，细胞体积较小，排列整齐，细胞核染色较深。瓣胃上皮细胞组成及形态与瘤胃相似，见图2。

2.3 瘤胃与瓣胃上皮细胞层数

日粮粗精比例对山羊瘤胃、瓣胃上皮细胞层数的影响见表3。

由表3可知，与PS组相比，PSC组山羊瘤胃上皮颗粒层和棘突层细胞总层数显著升高，而PSC组瓣胃上皮颗粒层和棘突层细胞总层数显著降低（P＜0.05）。结果表明，添加精料饲喂促进增加瘤胃上皮细胞层数，却减少瓣胃上皮细胞层数。

2.4 瘤胃与瓣胃上皮细胞周期

日粮粗精比例对山羊瘤胃、瓣胃上皮细胞周期的影响见表4。

由表4可知，PSC组山羊瘤胃上皮细胞S期和G2/M期细胞百分率均显著高于PS组（P＜0.05）；而PSC组山羊瓣胃上皮细胞S期和G2/M期细胞百分率均显著低于PS组（P＜0.05）。结果表明，添加精料饲喂加速瘤胃上皮细胞周期G1期进程，促进细胞增殖，而添加精料比率却抑制瓣胃增殖。

图1 瘤胃上皮乳头切片

图2 瓣胃上皮组织切片

表3 日粮粗精比例对山羊瘤胃、瓣胃上皮细胞层数的影响

表4 日粮粗/精比例对山羊瘤胃、瓣胃上皮细胞周期的影响 %

3 讨论

研究发现日粮添加精料加速瘤胃上皮细胞增殖，促进瘤胃上皮细胞生长。早在20世纪50年代，就有研究报道了日粮添加精料增大犊牛瘤胃体积，促进瘤胃乳头发育[5]。后续研究表明日粮添加精料促进青年奶牛瘤胃乳头生长，此结果是由饲料的高能量水平而并非饲料物理性状引起的[6]。但这些试验仅限于高能量日粮促进瘤胃上皮乳头增大的表观指标，而不清楚其机理。

本试验研究发现，日粮添加精料促进瘤胃上皮生长是通过缩短瘤胃上皮细胞周期进程，减速细胞增殖实现的。本试验中，瓣胃上皮结果与瘤胃相反，纯粗料日粮加速瓣胃上皮细胞增殖，促进瓣胃上皮细胞生长。此结果与在鼠结肠的一项研究结果类似，日粮添加纤维素比率可以降低降低G0/G1期细胞比率、提高S期细胞比率，促进细胞增殖[7]。不同精粗比率日粮对瘤胃、瓣胃上皮生长的差异性可能与瘤胃、瓣胃结构及功能的差异相关。

瘤胃中日粮的消化主要由微生物完成，瘤胃内微生物将食物发酵产生短链脂肪酸后被瘤胃上皮吸收；瓣胃的主要表现为“筛网”作用，通过瓣胃肌肉的剧烈收缩将大颗粒食物研磨成细小的颗粒；因而瓣胃上皮的发育可能对进入瓣胃食物的物理性状依赖性较强，但其具体机制还需进一步研究加以证明。

[1] Mcclure K E,Solomon M B,Loerch S C.Body weight and tissue gain in lambs fed an all-concentrate diet and implanted with trenbolone acetate or grazed on alfalfa[J].Journal of Animal Science,2000,78(5):1 117-1 124.

[2] Weigand E,Young J W,Mcgilliard A D.Volatile fatty acid metabolism by rumen mucosa from cattle fed hay or grain[J].Journal of Dairy Science,1975,58(9):1 294-1 300.

[3] Mcleod K R.Effects of diet forage:concentrate ratio and metabolizable energy intake on visceral organ growth and in vitro oxidative capacity of gut tissues in sheep[J].Journal of Animal Science,2000,78(3):760-770.

[4] Lu J,Zhao H,Xu J,et al.Elevated cyclin D1 expression is governed by plasma IGF-1 through Ras/Raf/MEK/ERK pathway in rumen epithelium of goats supplying a high metabolizable energy diet[J].Journal of Animal Physiology&Animal Nutrition,2013,97(6):1 170-1 178.

[5] Warner R G,Flatt W P,Loosli J K.Dietary factors influencing the development of the ruminant stomach[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,1956,4:788-792.

[6] Flatt W P,Warner R G,Loosli J K.Influence of Purified Materials on the Development of the Ruminant Stomach[J].Journal of Dairy Science,1958,41(11):1 593-1 600.

[7] Lupton J R,Coder D M,Jacobs L R.Long-term effects of fermentable fibers on rat colonic pH and epithelial cell cycle[J].Journal of Nutrition,1988,118(7):840.