分子标记辅助选择在陕恢206选育中的应用

张选明 李培江 张志奇 沙志鸿 刘志立 王小红 顾朝军 严洪庆

摘 要：水稻稻瘟病是汉中地区水稻的主要病害之一，选育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方法。该研究以同时含有稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-km的蜀恢527，含有稻瘟病抗性基因Pi-b的R150为基因供体配置杂交组合，利用Pi-ta、Pi-km和Pi-b的基因标记对分离世代进行基因位点检测，结合田间多代选育、抗性筛选将3个基因转育到同一品种，通过分子标记与田间多代性状筛选，选育出抗病、高产、优质水稻新品种“陕恢206”。研究表明，利用分子标记辅助选择，为选育多抗水稻品种提供了简单、便捷的选育方法，同时也为水稻抗病育种提供了新的遗传资源。

关键词：水稻；稻瘟病；分子标记辅助选择；Pi-ta；Pi-km；Pi-b

中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）09-0019-04

Application of Marker-Assisted Selection in Breeding of Shanhui 206

Zhang Xuanming et al.

（Shaanxi Rice Research Institute，Hanzhong 723000，China）

Abstract：Rice blast is the main disease of rice in Hanzhong area，breeding resistant varieties is the most effective way to prevent rice blast.Shuhui 527，containing both Pi-ta and Pi-km，was crossed with R150 which carried Pi-b.Three gene-markers Pi-ta and Pi-km and Pi-b were used for marker-assisted selection in each segregating generation.After the multi-generation breeding and identification of resistance，three resistance genes were put together finally.Through the molecular marker and field multi-generation character，breeding new varieties of disease resistance，high yield and high quality rice "Shanhui 206".These results indicated that marker-assisted selection could not noly be a simple and effective way but also provide genetic resources for breeding new rice multi-resistant varieties.

Key words：Rice；Rice blast；Marker-Assisted Selection；Pi-ta；Pi-km；Pi-b

稻瘟病是由子囊真菌（Magnaporthe grisea）引起的水稻病害，其危害面積与危害程度日趋严重，已成为限制水稻高产稳产的重要因子[1-2]。实践证明，培育抗性品种是防治稻瘟病最经济、有效的方法。由于稻瘟病病菌具有耐药性、易变异等特点，导致单一抗性品种不能够长期保持抗性。因此，筛选和利用广谱抗性基因以及利用分子技术将多个抗性基因整合到一个品种中，是选育持久抗性品种的必然趋势[3-4]。

传统的抗性育种主要依赖于表现型，而表现型容易受环境以及人为因素的干扰，从而降低了选育结果的可靠性及抗病育种效率。随着分子生物学技术的快速发展，水稻抗性育种已从传统技术转向分子技术，DNA分子标记、PCR（聚合酶链式反应）以及水稻全基因组测序的完成，都极大地推进了运用分子手段进行抗性育种，由于其直接、快捷、可靠且不受环境干扰的优点，也越来越受到人们的关注。截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点共84个主效基因，其中，Pi-ta，Pi-b，Pi-zt，Pi1，Pi2，Pi5，Pi9等24个基因已被成功克隆[5]。Pi-ta位于水稻第12染色体靠近着丝点附近的区域，由928个氨基酸残基编码组成的富含亮氨酸重复序列的细胞质膜受体蛋白[6]。Pi-b是来自日本抗性材料BL-1，该基因位于水稻第2染色体长臂近末端区域[7]。Ashikawa等通过序列分析和遗传互补实验研究表明，Pi-km是由2个紧密连锁的具有独立功能NBS-LRR类基因（Pi-km-TS和Pi-km2-TS）组成[8]。

本研究利用抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和Pi-km的特异性分子标记对育种分离世代水稻材料进行基因聚合，并结合田间世代选育，稻瘟病抗性鉴定，快速、准确选育出抗稻瘟病、产量高、优质新品种。不仅为水稻抗病育种提供了一种简单、快捷的选择方法，同时为水稻抗病育种提供了新的遗传资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料 强优抗病恢复系蜀恢527，含有稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-km，但不含抗性基因Pi-b；自育优质、籼粳交中间材料R150，含有稻瘟病抗性基因Pi-b；不育系陕农1A，中九A，宜香1A，内香5A。

1.2 抗病基因标记的选择 选择抗病基因Pi-ta在DNA序列上的单核苷酸长度多态性设计的等位基因特异性PCR引物YL155/YL87，用于检测Pi-ta基因[9]。选择抗病基因Pi-b在DNA序列上的多态性设计的特异性引物Pi-bdomF/Pi-bdomR，用于对Pi-b基因的选择[10]。由于Pi-km基因是由两个紧密连锁的具有独立功能NBS-LRR类基因组成，分别对2个基因设计引物Dkm1和Dkm2，用于检测Pi-km基因。引物名称、序列和扩增片段预期大小见表1，引物由上海生工公司合成。

1.3 DNA提取 采集分蘖盛期的试验材料叶片，用CTAB法提取全基因组DNA。

1.4 PCR扩增和电泳 PCR扩增体系为20μL：2μL 10×buffer，2μL DNA，2μL dNTP，1μL正反引物，0.5μL MgCl2，0.5μL Taq酶，11μL蒸馏水，PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃、45s，52℃、1min，72℃、45s，扩增重复34次，72℃延伸10min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，紫外灯下观察和检测。为保证实验的可靠性，每个DNA样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 利用分子标记辅助选择聚合Pi-ta、Pi-b和Pi-km基因 利用Pi-ta的基因标记对抗性基因的供体亲本和受体亲本PCR检测发现，Pi-ta标记能够在供体亲本中扩增出1042bp的目的条带，在受体亲本中不能扩增出目的条带。因此可以利用这对基因标记对分离群体中含有Pi-ta抗性的单株进行选择（图1）；利用Pi-b的基因标记对抗性基因的供体亲本和受体亲本PCR检测发现，Pi-b标记能够在供体亲本中扩增出365bp的目的条带，在受体亲本中不能扩增出目的条带。因此可以利用这对基因标记对分离群体中含有Pi-b抗性的单株进行选择（图2）；利用Pi-km的基因标记对抗性基因的供体亲本和受体亲本PCR检测发现，供体亲本中能够同时扩增出223bp和291bp的目的条带，在受体亲本中2条目的条带不能同时扩增出。因此可以利用这对基因标记对分离群体中含有Pi-km抗性的单株进行选择（图3、4）。

利用3对基因的分子标记对F4代分离群体的128个综合性状表现好的单株进行选择，获得了10株同时含有Pi-ta（纯合）、Pi-b（纯合）和Pi-km（纯合）抗病基因的单株。

2.2 聚合后代的抗性表现和农艺性状系统选育 2009年，将获得的10个单株分别种植成160苗的株系，用来自四川和汉中不同地区的5个稻瘟病生理小种对不同株系进行苗瘟和穗颈瘟接种鉴定，结果表明，10个株系对苗瘟和穗颈瘟都表现出很强的抗性。同时通过对分蘖力、成穗率、茎秆粗细等农艺性状的比较，选择综合性状较好的单株20株进行花药离体培养，加快稳定，于2009年冬在海南三亚进行种植，优选单株22株，于2010年在汉中种植，优选单株16株，进行编号，分别与陕农1A等多个不育系进行测配，其中编号为206株系与陕农1A所配组合结实率高，丰产性好，抗性强，米质优，表现突出。该株系经与多个不育系陕农1A，中九A，宜香1A，内香5A配组，F1代均表现结实率高，抗性强。该株系经5年南繁北育加代系统选育，现已进入F12代，表现遗传性稳定，分蘖力强、米质优、抗性强，定名为“陕恢206”，选育过程如图5所示。

图5 “陕恢206”的选育过程

2.3 “陕恢206”农艺性状 “陕恢206”综合性状好，全生育期162d，分蘖力较强，成穗率高，平均每穗总粒数168.6粒，结实率平均90.4%，千粒重平均32g，株高平均126.8cm，茎秆粗壮，抗倒伏，成熟转色佳，株叶形态良。稻米外观透明，垩白度2.1%，直链淀粉含量17.4%，胶稠度84mm，粒长宽比3.4，蛋白质含量8.3%，整体米质指标符合GB/17891—1999《优质稻谷》二级标准。经陕西省水稻研究所植保研究室抗病性鉴定，多点诱发鉴定表明：“陕恢206”对穗颈瘟病表现为高抗，对叶瘟表现为中抗；对纹枯病表现为中感；对稻曲病表现为中抗；人工接菌对白叶枯病表现为中感。

3 讨论

选育抗病、高产、优质水稻新品种仍是现阶段的主要育种目标，其中稻瘟病是我们一直致力攻克的对象。由于不同稻区的稻瘟病菌生理小种有可能不同，品种所表现的抗病性常常表现较大的差异。传统的改良品种抗性，往往需要依赖抗性鉴定和表型选择，而表现型受环境因素的干扰，选择效率低、工作量大、育种周期长，从而增加了育种难度。随着分子生物学的发展，推动了分子育种进程，而定位和克隆的大量稻瘟病抗性基因为MAS技术开展抗性育种奠定了基础。随着分子标记辅助选择技术的日益成熟，不但可加速抗病育种进程，还可以提高育种效率，越来越多的育种家利用与抗稻瘟病基因连锁的分子标记开展了水稻抗稻瘟病的分子标记辅助育种工作。由于稻瘟病生理小种的区域性差异和潜在的突变性，单一抗性基因不足以提高水稻的抗病性，因此，聚合多个抗病性基因到同一优良植株中是提高植株持久抗病性的有效手段。刘仕平等[11]研究表明，多个抗性基因的聚合后，并不简单的是单个抗病基因的抗谱之间的简单累加，而是抗性基因之间表现为极显著的基因互作，从而促使抗谱拓宽，抗性增强，使其能够抵抗单个抗病基因不能抵抗的生理小种。在聚合多个稻瘟病抗性基因方面，王军等[12]利用分子标记辅助选择聚合水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和条纹叶枯病抗病基因Stv-bi，选育出多抗、高产、优质粳稻新品系74121。刘武革等[13]利用分子标记辅助选择将稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2聚合到两系不育系GD-7S中，获得的后代既保持了GD-7S的农艺性状和配合力，又提高了株系的抗性水平。陈红旗等[14]利用分子标记辅助选择将稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2、Pi-33聚合到金23B中，培育出广谱、持久抗稻瘟病新材料W1。陈学伟等[15]将Pi-d（t）、Pi-b和Pi-ta抗性基因聚合到保持系杂交品种G46B中，显著提高了稻瘟病抗性水平。

4 结论

本研究利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pi-km分子标记对后代分离群体进行分子标记辅助选择，并结合田间抗性鉴定和常规育种技术，成功的将3个抗病基因进行聚合，选育出抗病、高產、优质恢复系水稻新品种“陕恢206”。实践证明，利用分子标记辅助选择技术将与抗病基因紧密连锁的分子标记对抗性基因进行检测和筛选，再通过常规育种技术，可以快速准确地聚合多个抗病基因，为水稻抗病育种提供一种高效、简单、快捷的选育方法。

参考文献

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（责编：张宏民）