硒对铜胁迫酿酒葡萄幼苗生理特性的影响

朱娟娟 马海军

摘要：【目的】探讨亚硒酸钠（Na₂SeO₃）对铜胁迫酿酒葡萄幼苗生理特性的影响，为揭示硒元素缓解酿酒葡萄幼苗铜胁迫作用提供参考依据。【方法】以宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄产区淡灰钙土在温室中盆栽酿酒葡萄赤霞珠，分析添加外源硒（1.0 mg/kg）对铜胁迫（300.0 mg/kg）酿酒葡萄幼苗叶片光合色素含量、抗氧化酶[过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）]活性、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白含量的影响。【结果】与对照（CK）相比，1.0 mg/kg硒处理能提高酿酒葡萄幼苗叶片的叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和总叶绿素（Chl a+b）含量及POD和CAT活性，降低MDA含量，但对SOD活性和可溶性蛋白含量无显著影响（P>0.05）；300.0 mg/kg铜胁迫可显著降低葡萄幼苗叶片的叶绿素（Chl）和可溶性蛋白含量（P<0.05，下同），提高Chl a/b、抗氧化酶活性及MDA含量；1.0 mg/kg晒+300.0 mg/kg铜处理的葡萄幼苗叶片Ch1和可溶性蛋白含量与CK相当，但均高于300.0 mg/kg铜胁迫处理，SOD、POD和CAT活性比300.0 mg/kg铜胁迫处理略有降低，MAD含量显著低于300.0 mg/kg铜胁迫处理。【结论】铜胁迫条件下，低浓度（1.0 mg/kg）硒元素能提高酿酒葡萄幼苗对逆境的耐受力，提高叶片抗氧化酶活性，降低叶片细胞膜质过氧化程度，进而缓解铜对葡萄幼苗的毒害作用。

关键词：酿酒葡萄；铜胁迫；硒；光合色素；抗氧化酶活性

0引言

【研究意义】铜是植物生长发育必需的微量元素，其制剂是果树上使用最多的一类杀菌剂。但铜属于无机元素，在环境中移动性差，不可降解，随着现代农业中铜制剂的大量长期施用，铜胁迫对葡萄园生态环境已产生积累性污染（卜元卿等，2013；徐秋桐等，2014），直接影响葡萄的生长发育及果实和葡萄酒的品质。大量研究表明，过量的铜抑制植物光合作用和呼吸作用，降低酶活性，诱发细胞内活性氧产生，加速H²O²向毒性更强的O^2-转化，增加膜透性，导致细胞内物质外渗，代谢失调，破坏DNA结构，进而导致植株生长受阻（肖志华等，2012；杨昱和秦樊鑫，2014）。硒元素对高等植物的生长发育具有重要的生理和功能性作用（Gasecka et al，2016），低浓度硒可调控植物的光合和呼吸作用，促进植株生长发育，提高体内营养成分含量，改善农产品品质及增强植物抗逆性（朱丽琴等，2007；Proiettia et al，2013）。同时，硒元素不仅能增强杀菌剂的杀菌作用，还具有抗氧化作用并拮抗环境毒害、减少植物对重金属的吸收，从而保护植物免受重金属毒害（Li et al，2012）。因此，探讨外源硒（Na²Se0³）对铜胁迫酿酒葡萄幼苗生理特性的影响，对实际生产中提高酿酒葡萄果实硒含量、改善其品质及缓解铜胁迫的毒害具有重要意义。【前人研究进展】林义章等（2008）研究发现，铜胁迫小白菜的叶绿体结构发生变形，基质类囊体结构膨胀，随着铜含量的增加，细胞膜逐步瓦解，叶绿体的基粒消失。铜元素除对植物光合作用产生显著影响外，对植物体根系发育及养分吸收等也有显著影响（Lomnardi and Sebastiani，2005）。此外，葡萄酒酿造过程中，原料中过量的铜不但影响酵母的存活率，而且显著影响酵母對还原糖的发酵性能，最终影响CO²和酒精的产量（王巧碧等，2016）；同时，葡萄酒中铜过量还会加速酚类物质的氧化，导致葡萄酒产生金属破败（Sun et al，2016），降低葡萄酒质量。叶面喷施硒元素能提高葡萄（朱丽琴等，2007）、苹果（宁婵娟等，2013）和梨（王斐等，2014）等果实的硒含量，显著增加果实可溶性固形物含量，改善果实品质。黄丽美等（2017）研究发现，硒具有抗氧化及修复叶绿体的作用，能清除植物体内由重金属胁迫产生的有害氧化性物质，调节机体维持体内氧化还原物质处于正常水平，保护膜结构和功能的完整性，提高植物抗逆性，达到缓解重金属胁迫的目的；硒与金属元素问具有很强的结合力，可降低砷、汞、铅、铬和镉等重金属元素对生物体的毒害。【本研究切入点】目前，有关硒对重金属胁迫的研究主要集中于小麦（李瑞平等，2011）、水稻（刘春梅等，2015）、油菜（彭玲等，2015）、玉米（黄丽美等，2017）和蔬菜（赵秀峰等，2017）等作物上，针对铜胁迫酿酒葡萄幼苗生理特I生影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过温室盆栽试验，探讨外源硒对铜胁迫赤霞珠（Cabemet Sauvignon）葡萄幼苗叶片光合色素含量、抗氧化酶[过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）]活性、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白含量的影响，揭示适量硒对铜胁迫毒害葡萄幼苗的缓解作用，为生产中提高酿酒葡萄果实硒含量、改善其品质及缓解铜胁迫提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试葡萄品种为欧亚种酿酒葡萄赤霞珠1年生扦插苗，供试土壤为宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄产区淡灰钙沙土。供试铜源硫酸铜（CuSO₄·5H₂0）、硒源亚硒酸钠（Na₄SeO₃）购自成都化夏化学试剂有限公司。

1.2试验方法

盆栽试验于2016年5～12月在北方民族大学生物科学与工程学院日光温室中进行。选取生长势一致、具6～9片叶片的1年生赤霞珠葡萄扦插苗移栽于高30 cm、盆口直径25 cm、盆底直径13 cm的塑料花盆中，每盆盛干沙土10.5kg，施氮磷钾复合肥20.0g，每盆移栽1株幼苗，充分灌水使土壤水含量基本一致。待缓苗生长3个月后，挑选生长一致的36盆幼苗进行试验处理。依据《GB15618-1995土壤环境质量标准》设置铜和硒处理水平。试验采用完全随机区组设计，共4个处理，分别为：对照（CK，不施铜和硒）、1.0 mg/kg硒处理（硒处理）、300.0 mg/kg铜处理（铜处理）和1.0 mg/kg硒+300.0 mg/kg铜处理（硒+铜处理），每处理3次重复，每重复3株幼苗。铜和硒含量折算后配制成对应的溶液，硒或铜处理一次性将硒或铜溶液均匀喷人土壤，而硒+铜处理先一次性均匀喷入铜溶液，平衡24 h后再一次性喷人硒溶液；定期浇水，保持土壤水含量为15%～20%，30 d采集样品进行相关指标测定。采样时随机选取幼苗顶部向下3节位内的叶片，每次每株采集1片，用自封袋密封后置于冰盒中保存，带回实验室用去离子水洗干净，用吸水纸擦干，去除主叶脉，剪碎混匀后置于-80℃冰箱中保存备用。

1.3测定指标及方法

1.3.1抗氧化酶活性测定粗酶液提取：称取0.5 g叶样品放人研钵中，加5.0mL 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8），冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20 min（10000r/min），取上清液（酶液）分装于1.5mL离心管中，置于-20℃下保存待用。参照张志良等（2009）的方法，采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化学还原反应法测定SOD活性，采用愈创木酚法测定POD活性，采用紫外分光光度法测定CAT活性。

1.3.2 MDA和可溶性蛋白含量测定参照张志良等（2009）的方法，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，采用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量。

1.3.3叶片光合色素含量测定参照张志良等（2009）的方法，采用丙酮一乙醇法测定叶片光合色素含量，利用下列公式计算叶绿素（Chl）和类胡萝卜素（Car）含量。

1.4统计分析

采用SAS 8.0对试验数据进行方差分析，以LSD法进行多重比较，以Excel 2007制图。

2结果与分析

2.1硒对铜胁迫酿酒葡萄幼苗叶片光合色素含量的影响

光化学反应中心是由叶绿体内的光合色素组成，其含量直接影响光合速率。从图1可看出，硒处理能提高酿酒葡萄幼苗叶片的Chl a、Chl b、总叶绿素（Chl a+b）和Car.含量，分别比CK增加0.93%、13.5%、3.76%和6.35%，但差异不显著（P>0.05，下同）；铜处理能显著降低酿酒葡萄幼苗叶片的Chl a、Chl a+b和Car.含量（P<0.05，下同），明显降低Chl b含量；硒+铜处理下酿酒葡萄幼苗叶片的Chl a、Chl b和Chl a+b含量略高于CK，差异不显著，但显著高于铜处理，Car.含量低于CK，明显高于铜处理。从图1还可看出，各处理问的Chl a/b和（Chl a+b）/Car.均无显著差异，但硒+铜处理的Chl a/b和（Chl a+b）/Car.略低于铜处理。说明土壤中施用1.0 mg/kg硒可提高葡萄幼苗对300.0 mg/kg铜胁迫的耐受力。

2.2硒对铜胁迫酿酒葡萄幼苗叶片MDA和可溶性蛋白含量的影响

从图2-A可看出，硒处理可显著降低葡萄叶片的MDA含量，铜处理可明显提高葡萄叶片的MDA含量，但与CK差异不显著；硒+铜处理葡萄叶片的MDA含量显著低于CK和铜处理。从图2-B可看出，硒处理葡萄叶片的可溶性蛋白含量略低于CK，二者差异不显著；铜处理葡萄叶片的可溶性蛋白含量最低，显著低于CK，但与硒处理和硒+铜处理差异不显著。说明土壤中施用1.0 mg/kg硒能显著降低300.0mg/kg铜胁迫葡萄幼苗叶片的MDA含量，明显提高可溶性蛋白含量，从而降低铜对葡萄幼苗的细胞膜质过氧化作用，提高其保水能力，缓解逆境对其造成损伤。

2.3硒对铜胁迫酿酒葡萄幼苗抗氧化酶活性的影响

抗氧化酶系统是植物处于逆境时的重要保护机制，通过调控酶活性的变化，可缓解逆境对植物的损伤。从图3-A和图3-B可看出，硒处理葡萄幼苗叶片的SOD活性和比活力分别为239.6 U/mgFW和5.27 U/mg，均略低于CK。从图3-C和图3-D可看出，硒处理葡萄幼苗叶片的POD活性和比活力分别为223.5 U/mgFW和21.88 U/mg，均明显高于CK。从图3一E和图3一F可看出，硒处理葡萄幼苗叶片的CAT活性和比活力分别为110.5 U/mgFW和10.46 U/mg，均显著高于CK。从图3还可看出，铜处理可显著提高葡萄幼苗叶片的SOD、POD、CAT活性及比活力；硒+铜处理与铜处理问的SOD、POD、CAT活性及比活力均存在一定差异，但差异不显著。说明硒元素对酿酒葡萄幼苗的保护作用可能主要通过非酶抗氧化物质而不是通过提高抗氧化酶活性完成。

2.4光合色素、MDA含量、抗氧化酶活性及比活力间的相关性分析结果

从表1可看出，硒对铜胁迫葡萄幼苗叶片的Chla+b含量与MDA含量呈显著负相关，表明叶片的MDA含量越高，其Chl含量越低，MDA含量越低则Chl含量越高；Car.含量与SOD比活力也呈显著负相关，表明叶片的Car.含量越高，其SOD比活力越低，Car.含量越低则SOD比活力越高；其他指标间均无显著相关性。

3讨论

王娅玲等（2016）研究认为，铜离子作为叶绿体质体蓝素组成部分参与茶树的光合作用，也是某些叶绿素合成酶的活化剂，高含量铜对茶树有明显的毒害作用，引起茶树体内酶系统紊乱，叶绿素合成受阻。本研究结果与其相似，300.0 mg/kg铜胁迫会降低酿酒葡萄幼苗叶片的Chl a、Chl b、Chl a+b和Car.含量，可能是因为葡萄幼苗吸收的铜离子与合成Chl相关酶肽链中富含巯基的部分结合，改变了酶的结构，抑制了Chl合成酶的活性，导致光合强度降低（葛淑芳等，2014），也可能是因为高浓度铜离子促使叶绿体酶体失活，叶绿体分解加快的结果（李永杰等，2010），与谭明明等（2014）对甜瓜的研究结果一致。王丽霞（2010）研究发现，硒是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的组分，也参与辅酶A和辅酶Q的合成，一定浓度（<0.1 mg/L）的硒可增强线粒体呼吸速率和叶绿体电子传递速率，超出阈值（≥1.0 mg/L）时则导致其速率降低。本研究结果表明，施用硒能提高葡萄幼苗的Chl含量，單一施人低浓度（1.0 mg/kg）硒可提高葡萄幼苗叶片的Chl a、Chl b、Chla+b和Car.含量，而300.0 mg/kg铜胁迫下施入1.0 mg/kg硒可减小葡萄幼苗叶片Chl a、Chl b、Chla+b和Car.含量的下降幅度，且可降低Chl a/b和提高（Chl a+b）/Car，表明硒能提高葡萄幼苗对铜胁迫的耐受力，与胡斌等（2011）对小白菜的研究结果一致。

植物抗氧化酶系统活性的变化及膜脂过氧化作用能反映植物对逆境的响应，SOD、POD和CAT等组成的抗氧化系统是植物的重要保护机制，当植物遭受逆境胁迫时，植物体内SOD、CAT和POD活性迅速升高，可有效清除活性氧自由基，保护细胞免受活性氧的伤害。SOD是植物抗氧化的第一道防线，能将多余的超氧阴离子歧化为H₂O₂和O₂，随后H₂