内部沸腾法提取火龙果果皮多糖工艺优化

郑韵英,黄琼慧,严业雄,李水源,颜荣森,钟书明,尹艳镇

(1.钦州学院石油与化工学院,广西钦州 535099;2.钦州学院石油与化工学院,钦州市生物废弃物资源富硒功能化利用重点实验室,广西钦州 535000)

火龙果是一种高维生素,低糖类,低脂肪的,一高两低的水果[1],目前,在我国广泛种植于广东、广西、海南、福建等地[2]。火龙果营养价值极高,果肉鲜美甘甜,果皮肉质化,富含多糖等生理活性物质,多糖具有清除自由基、抗疲劳、抗炎等生理功能,并且在抑制肿瘤、抗氧化性、抗凝血、调节免疫力等方面发挥重要作用[3-6]。火龙果果皮也同样含有多糖等多种生理活性成分[7],然而在日常食用及食品加工过程中,果皮往往会被忽略,火龙果果皮约占整个果重的25%[8],若将其充分利用,可使火龙果资源得到更加合理的开发与利用,有效提高火龙果的经济附加值。

目前,国内外以火龙果果皮为主要原料提取其有效成分的研究报道较多,如提取黄酮[9]、花青素[10]、膳食纤维[11]、果胶[12]等,而针对火龙果果皮多糖提取工艺的研究尚未见到。内部沸腾提取技术是一项快速、高效而且在天然产物提取有较好效果的实验方法,目前该方法广泛应用于植物有效活性成分的提取[13-14]。文献[15-18]采用内部沸腾法提取多糖均取得很好的效果,同时也表明了该方法具有用时短、杂质少、效果好、收率高和操作简单等优势。本实验以红皮白肉火龙果的果皮为实验材料,因多糖属于极性大分子,呈弱酸性,所以常选用水,乙醇等极性较强的溶剂进行提取[19],因此本实验优选用乙醇作为解吸剂,水作为提取剂,以火龙果果皮中多糖提取率为考察指标,采用内部沸腾法提取火龙果果皮多糖,在单因素设计的基础上设计正交实验优化火龙果果皮多糖提取工艺条件,为火龙果果皮的保健功能及药用功能开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

火龙果,红皮白肉椭圆形,外表鳞片状,单果质量约350 g 广西钦州市火龙果山庄种植基地;葡萄糖、硫酸、苯酚 国药集团化学试剂有限公司,以上化学试剂均为分析纯试剂。

SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城仪器有限公司;LGJ-10C真空冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司;RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;M20研磨机 德菲科仪;UV-1950紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;BPZ-6090LC真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;HR/T16台式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 火龙果果皮的制备方法 新鲜的火龙果去除果肉后,将果皮用水洗净后晾干表面水分,切成小块后冷冻干燥,将干燥的火龙果果皮粉碎后过80目分子筛,备用。

1.2.2 标准曲线的制作 采用苯酚-硫酸法[15],首先将葡萄糖放置105 ℃干燥箱内干燥至恒重,而后精确称量已恒重的葡萄糖0.0152 g,将其溶解配制为100 mL葡萄糖溶液,于6支比色管中分别吸取该溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,加水补充至2.0 mL,再加1.0 mL 5%苯酚溶液,迅速加入浓硫酸5.0 mL,摇匀,静置20 min,冷却至室温,以空白为对照,在490 nm的波长下测定其吸光度,以吸光度为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:Y=0.671X-0.0005,R2=0.9997。

图1 多糖标准曲线Fig.1 Standard curve of polysaccharide

1.2.3 火龙果果皮多糖的提取及计算 首先准确称量1.00 g火龙果果皮干粉,加入一定量一定浓度的乙醇解吸剂解吸一段时间,然后加入一定温度一定体积的水放置一定的时间,提取两次,减压抽滤,得到提取液并稀释至100 mL,准确移取1.00 mL上述稀释液至25 mL容量瓶中稀释定容,备用。从上述25 mL容量瓶中准确移取1.00 mL稀释液置于25 mL比色管中,然后依次在比色管中加入1.0 mL蒸馏水,加入1.00 mL 5%苯酚溶液,摇匀,迅速加入5.00 mL浓硫酸,盖上塞,摇匀,在室温显色20 min,以空白作为对照,于490 nm处测定其吸光度,根据标准回归方程计算总糖质量浓度,按式(1)计算总糖含量,按式(2)计算火龙果果皮多糖提取率[19]:

式中,W总为火龙果果皮总糖质量,g;C为火龙果果皮提取液浓度,mg/mL;W为火龙果果皮样品质量,g;E为火龙果果皮多糖提取率,%。

1.2.4 内部沸腾法提取火龙果果皮多糖的工艺

1.2.4.1 解吸剂浓度的影响 准确称取1.00 g火龙果果皮粉末于烧杯中,加入5.0 mL 50%、60%、70%、80%、90%乙醇解吸15 min,然后迅速加入温度为90 ℃的蒸馏水25.0 mL即料液比为1∶25 (g/mL),恒温提取6 min,提取2次。

1.2.4.2 解吸剂用量的影响 准确称取1.00 g火龙果果皮粉末于烧杯中,加入5.0 mL 80%乙醇3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL,充分解吸25 min,然后迅速加入温度为90 ℃的蒸馏水25.0 mL即料液比为1∶ 25 (g/mL),恒温提取6 min,提取2次。

1.2.4.3 解吸时间的影响 准确称取1.00 g火龙果果皮粉末,加入80%乙醇解吸剂5.0 mL,放置10、15、20、25、30 min进行解吸。然后迅速加入温度为90 ℃的蒸馏水25.0 mL即料液比为1∶25 (g/mL),恒温提取6 min,提取2次。

1.2.4.4 提取温度的影响 准确称取1.00 g火龙果果皮粉末,加入5.0 mL 80%乙醇解吸15 min,然后迅速加入25.0 mL温度为60、70、80、90、100 ℃的蒸馏水即料液比为1∶25 (g/mL),在恒温的条件下提取6 min,提取2次。

1.2.4.5 料液比的影响 准确称取1.00 g火龙果果皮粉末,加入5.0 mL80%乙醇解吸15 min,然后按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)的用水量迅速加入其中,在温度为90 ℃的条件下温提取6 min,提取2次。

1.2.4.6 提取时间的影响 准确称取1.00 g火龙果果皮粉末,加入5.0 mL80%乙醇解吸15 min,料液比为1∶25 (g/mL),在温度为90 ℃的条件下恒温提取4、5、6、7、8 min,提取2次。

1.2.5 正交实验设计 根据单因素的实验,选取对火龙果多糖提取率影响较为明显的三个因素(解吸剂浓度、料液比及提取温度)设计L9(33)即3因素3水平正交实验,详见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 验证实验 根据实验结果,于100 mL烧杯中放入1.00 g火龙果果皮粉末,加入5.0 mL浓度为80%的乙醇解吸15 min,然后再加入90 ℃ 25.0 mL的蒸馏水恒温提取6 min。提取两次。

1.3 数据统计分析

采用正交设计助手ⅡV3.1软件对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 内部沸腾法提取火龙果果皮多糖的工艺条件

2.1.1 解吸剂浓度对火龙果果皮多糖提取的影响 由图2可知,解吸剂浓度(即乙醇的浓度)在50%～80%之间,火龙果果皮多糖提取率逐渐升高,当解吸剂浓度为80%时,火龙果果皮提取率达到最大值,当解吸剂浓度继续升高,提取率下降。根据有机物相似相容原理,60%～80%的乙醇渗透植物细胞壁的能力是最好的,而80%乙醇溶液能充分渗透火龙果果皮细胞壁,使火龙果果皮多糖得以充分解吸,当乙醇浓度过高时,水溶性多糖易形成沉淀,多糖溶解度变小,解吸不充分,从而导致火龙果果皮多糖提取率下降。因此选择解吸剂浓度为80%乙醇。

图2 解吸剂浓度对火龙果果皮多糖提取率的影响Fig.2 The effect of releasing concentration on extraction rate of polysaccharide from pitaya peel

2.1.2 解吸剂用量对火龙果果皮多糖提取的影响 由图3可知,随着解吸剂用量的不断提高,火龙果果皮多糖提取率不断增加,当用量达到5 mL以后,火龙果果皮多糖提取率上升非常缓慢,趋于平稳。原因可能是:解吸剂用量少时,溶剂渗透物料内部不完全,解吸不充分,影响多糖分子的溶出;当解吸剂用量达到5.0 mL时,解吸剂完全渗透火龙果果皮物料内部,有利于多糖分子充分溶出,提取率较高,继续增加解吸剂的用量,火龙果果皮多糖提取率没有明显增加。因此,从节约资源的角度考虑,选择解吸剂用量为5.0 mL。

图3 解吸剂用量对火龙果果皮多糖提取率的影响Fig.3 The effect of releasing amount on extraction rate of polysaccharide from pitaya peel

2.1.3 解吸时间对火龙果果皮多糖提取的影响 由图4可以看出,解吸时间在10～15 min时间段内,提取率增加很快,当解吸时间达到15 min时,提取率最高,15 min以后火龙果果皮多糖提取率趋于平稳。原因可能是:溶剂与物料之间的作用时间短,溶剂未能充分渗透果皮细胞壁,将火龙果果皮内部多糖成分充分解吸,从而影响多糖提取率。随着时间的增加,渗透越来越充分,解吸更充分,火龙果果皮多糖溶出越来越多,提取率越来越高,15 min提取率达到最大,再增加时间提取率基本不变。因此选择解吸时间为15 min。

图4 解吸时间对火龙果果皮多糖提取率的影响Fig.4 Releasing time on extraction rate of polysaccharide from pitaya peel

2.1.4 料液比对火龙果果皮多糖提取的影响 由图5可以看出,火龙果果皮提取率先随着用水量的增加而升高而后趋于恒定,原因可能是用水量逐渐增加,遗留在火龙果果皮内部的糖分逐渐减少,多糖提取率逐渐升高,当用水量为物料的25倍,即料液比为1∶25 (g/mL)时,提取率最高,提取已基本完成,再增加用水量,火龙果果皮提取率趋于平稳。因此选择料液比为1∶25 (g/mL)。

图5 料液比对火龙果果皮多糖提取率的影响Fig.5 Effect for ratio of material to solution on extraction rate of polysaccharide from pitaya peel

2.1.5 提取温度对火龙果果皮多糖提取的影响 由图6可知,火龙果果皮多糖提取率随着温度的上升而升高,当提取温度升至90 ℃时,提取率达到最高值,再继续升高温度,火龙果果皮多糖提取率反而下降了。原因可能是:温度较低,多糖溶出较为困难[20],导致物料内部多糖分子扩散较难,从而影响提取率;而温度较高,物料内部沸腾迅速,分子扩散时间短,火龙果果皮多糖未能及时溶出,提取过程已结束,同时温度过高,多糖也会因其热不稳定性而产生分解[21],从而导致提取率下降,因此选择提取温度为90 ℃。

图6 提取温度对火龙果果皮多糖提取率的影响Fig.6 The effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharide from pitaya peel

2.1.6 提取时间对火龙果果皮多糖提取的影响 由图7可以看出,火龙果果皮多糖的提取率随着时间的增加而增加之后趋于平稳,主要原因是提取时间短,反应体系分子间相互作用不充分,提取效果差,当提取时间达到6 min时,物料分子间已充分接触,提取充分,火龙果果皮多糖提取率高。随延长时间,提取率基本不变,从节约时间的角度考虑,选择提取时间为6 min。

图7 提取时间对火龙果果皮多糖提取率的影响Fig.7 The effect of extraction time on extraction rate of polysaccharide from pitaya peel

2.2 正交实验结果

综合单因素实验结果,在解吸过程中选取解吸剂用量为5 mL,解吸时间15 min,在提取的过程中选取提取时间为6 min,通过L9(33)正交实验,考察解吸剂浓度、提取温度、料液比三个因素对火龙果果皮多糖提取的影响,结果见表2。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test

由正交实验结果可以看出,影响火龙果果皮多糖提取率的因素由大到小的顺序依次为:提取温度、解吸剂浓度、料液比。综合单因素及正交实验结果分析,可得最佳工艺条件为:A2B2C2,即解吸剂浓度80%、料液比为1∶25 (g/mL)、提取温度90 ℃。

2.3 验证实验结果

根据最优的提取工艺条件,进行三次平行实验,求取平均值,结果见表3。

表3 验证实验Table 3 Verification test

由表3可以看出,平行三次实验结果得到火龙果果皮多糖提取率为5.81%,实验表明,内部沸腾法提取火龙果果皮多糖具有稳定性和可行性。

3 结论

采用内部沸腾法提取火龙果果皮多糖,首先考察解吸过程和提取过程中6个单因素对火龙果果皮多糖提取工艺的影响,然后根据单因素的实验结果进行正交设计实验,最后通过平行实验验证。结果表明内部沸腾法提取火龙果果皮多糖的最佳工艺参数为:解吸剂浓度为80%乙醇、解吸剂用量为5 mL/g、解吸时间为15 min、提取温度为90 ℃、料液比为1∶25 (g/mL)、提取时间为6 min。在该条件下火龙果果皮多糖提取率为5.81%。内部沸腾法提取火龙果果皮多糖,所用时间比较短、而且提取液中杂质含量少,有机溶剂用量极少,极大地减少对环境的污染,提取收率高,所需实验设备简单,设备投资小,节约经费开支,为火龙果果皮的进一步开发应用提供理论基础。

[1]杨明,胡文娥,吴寿中.微波辅助提取火龙果果皮中果胶工艺[J].食品研究与开发,2012,33(2):55-58.

[2]杨志娟,曾真,吴晓萍.火龙果果皮原花青素提取纯化及定性分析[J].食品科学,2015,36(2):75-79.

[3]Dong C X,Hayashi K,Mizukoshi Y,et al. Structures of acidic polysaccharides fromBasellarubraL. and their antiviral effects[J]. Carbohydr Polym,2011,84(3):1084-1092.

[4]Zhang M,Cui S W,Cheung P C K,et al. Antimumor polysaccharides from mushrooms:A review on their isolation process,structural characteristics and antitumor activity[J]. Trends Food Sci Tech,2007,18(1):4-19.

[5]Majdoub H,Mansour M B,Chaubet F,et al. Anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide from the green alga Arthrospira platensis[J]. Biochim Biophys Acta,2009,1790(10):1377-1381.

[6]Luo Q,Sun Q,Wu L S,et al. Structural characterization of an immunoregulatory polysaccharide from the fruiting bodies of Lepista sordida[J]. Carbohydr Polym,2012,88(3):820-824.

[7]黄梅华,何全光,淡明,等. 火龙果果皮乳酸菌发酵产品体外抗氧化能力研究[J]. 食品工业科技,2017,38(17):70-74,79.

[8]王雪,丁金龙,黄苇,等.火龙果果皮中果胶的提取及其结构研究[J].中国食品添加剂,2015(3):102-106.

[9]王晓波,钟婵君,刘冬英,等.火龙果果皮总黄酮对油脂抗氧化作用的研究[J].食品研究与开发,2012,33(3):19-23.

[10]马冰雪,潘腾,任中清,等.火龙果果皮花青素提取工艺研究[J]. 北京农业,2013(12):213-215.

[11]张玉锋,孙丽平,庄永亮,等.火龙果果皮中膳食纤维含量及其物理化学特性[J].食品科学,2012,33(19):164-167.

[12]刘倩倩.超声波辅助提取火龙果果皮中水溶性膳食纤维工艺研究[J].食品工业科技,2015,36(18):257-260,266.

[13]郑韵英,童张法,韦滕幼. 内部沸腾法提取银叶树叶中总黄酮的研究[J].广西大学学报:自然科学版,2013,38(3):527-531.

[14]曾淼洋,韦藤幼,童张法. 加酸内部沸腾法提取氯化两面针碱及其纯化研究[J].高校化学工程学报,2014,28(4):719-724.

[15]陈晓光,韦藤幼,彭梦微,等.内部沸腾法提取香菇多糖的工艺优化[J].食品科学,2011,32(10):31-34.

[16]翁艳英,韦藤幼,童张法.内部沸腾法提取三七多糖的研究[J]. 时珍国医国药,2011,22(6):1435-1436.

[17]温拥军,蒋琼凤,郭浪.响应面法优化内部沸腾法提取三七多糖[J]. 食品工业科技,2013,34(23):260-263.

[18]许英伟,肖小年,刘剑青,等. 响应面法优化内部沸腾法提取生米藠头多糖[J]. 南昌大学学报：理科版,2012,36(5):449-452.

[19]蔡锦源,许金蓉,孙松,等. 响应面法优选火龙果多糖的微波提取工艺研究[J].河南工业大学学报：自然科学版,2015,36(3):65-70.

[20]张淑杰,康玉凡. 天然活性多糖研究进展[J]. 食品工业科技,2017,38(2):379-382,389.

[21]马钊,李景明,李丽梅,等. 洋葱多糖提取工艺的研究[J].食品工业科技,2005,26(5):98-99.