干旱胁迫下不同抗旱水平马铃薯叶片蛋白质组学分析

张凤军， 叶景秀， 师 理， 阮建平， 王 舰

(1.青海大学农林科学院，青海西宁 810016； 2.青海省农林科学院，青海西宁 810016；3.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海西宁 810016；4.青藏高原生物技术教育部重点实验室，青海西宁 810016； 5.青海省马铃薯育种重点实验室，青海西宁 810016)

我国是传统农业大国，干旱是影响农业生产的重要因素之一，是造成我国农业生产不稳定的主要原因[1-2]。在我国尤其是干旱和半干旱地区，缺水问题一直是限制农业生产的最主要因子之一，即使是降水较多的地区也普遍存在季节性和非周期性干旱问题[3]。马铃薯是重要的粮、菜、饲兼用作物，栽培范围遍布全球，常年播种面积稳定在2 000万hm2左右。近年来我国马铃薯的种植面积得到迅速发展，种植面积达到500多万hm2，占全球种植面积的20%以上[4]。马铃薯是对水分亏缺较为敏感的作物，受干旱影响较大，而我国马铃薯的主要种植省区都或多或少存在干旱问题[5]，干旱使这些地区马铃薯产量的损失超过了其总产量的30%[6]。

植物在逆境胁迫条件下，基因表达发生改变，一些正常基因被关闭，而一些与适应逆境有关的基因则被启动，表现出正常蛋白合成受阻，而诱导合成特异蛋白即逆境蛋白[7-8]。已经发现许多逆境因子如干旱、盐碱、低温、高温等，都会引起植物基因表达的变化，诱导产生逆境蛋白。植物感受这些逆境信号后通过信号转导过程调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，进而调整自身的生理状态或形态的改变来适应不利环境。因此，寻找与抗逆相关蛋白(或基因)对了解植物抗逆机制以及提高植物抗逆性能有着十分重要意义。

本试验探究不同抗旱性马铃薯品种(耐旱品种青薯9号[9]，干旱敏感品种费乌瑞它)在干旱胁迫下盛花期蛋白水平的响应，发掘与马铃薯抵御干旱胁迫相关的蛋白，为后续的抗旱基因克隆和分子育种工作提供有力支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验处理

试验材料为耐旱品种青薯9号和干旱敏感品种费乌瑞它，均由青海省农林科学院生物技术研究所提供。试验于2015年4—9月在青海省农林科学院试验地简易干旱棚中进行，试验设盛花期干旱胁迫处理和全生育期正常供水对照处理。达到处理时间要求的最后1天09：00取3株顶叶下完全展开叶第4片复叶，去掉叶柄，混合放入封口袋，置于-80 ℃冰箱中保存备用[10]。

1.2 蛋白质提取

采用TCA-丙酮法[11-12]提取马铃薯叶片总蛋白，蛋白浓度参考Bradford法[13]测定。

1.3 双向电泳、图谱分析及质谱鉴定

双向电泳操作参考叶景秀等[11]、章玉婷等[12]的方法进行(第一向IEF-PAGE，pH值为4～7的非线性IPG干胶条；第二向SDS-PAGE电泳，浓度12%的聚丙烯酰胺凝胶)进行分离，经考马斯亮蓝染色后，获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。使用PDQuest 8.0.1分析软件对双向电泳图谱进行分析，对找出的差异蛋白点，将差异表达的目标蛋白质点经过处理后进行串联质谱(MALDI-TOF-MS)分析，通过Mascot、Peptldent等数据库，对其序列进行同源性比对，鉴定耐旱的特异蛋白。

2 结果与分析

2.1 不同抗旱水平马铃薯盛花期叶片蛋白质组图谱比较

青薯9号盛花期胁迫与对照相比，表达量超过对照1.5倍的蛋白质点有26个；对照表达量超过胁迫1.5倍的蛋白质点有21个，新产生蛋白1个(图1)。费乌瑞它盛花期胁迫与对照相比，表达量超过对照1.5倍的蛋白质点有8个，新产生蛋白4个；对照表达量超过胁迫1.5倍的蛋白质点有21个，新产生蛋白1个(图2)。

2.2 不同抗旱水平马铃薯盛花期叶片差异蛋白的鉴定

青薯9号共鉴定出47个差异蛋白(表1、表2)，可将它们分为5类(图3)，分别为：(1)光合作用相关蛋白14个(占 29.79%)，其中胁迫处理鉴定出的有8个，对照处理鉴定出6个；(2)物质和能量代谢相关蛋白15个(占31.91%)，其中胁迫处理鉴定出的有9个，对照处理鉴定出6个；(3)抗氧化和防御相关蛋白8个(占17.02%)，其中胁迫处理鉴定出的有5个，对照处理鉴定出3个；(4)信号传导和生长发育相关蛋白8个(占17.02%)，其中胁迫处理鉴定出的有3个，对照处理鉴定出5个；(5)未知功能蛋白2个(占4.26%)，其中胁迫处理的有1个，对照处理鉴定出1个。

由图3和表1、表2可见，胁迫处理下的青薯9号在盛花期除光合作用差异蛋白质点表达数量大于对照处理外，其他几类功能蛋白差异不大，可见由于青薯9号本身抗旱性强，胁迫和对照处理下均能建立起强大的抗旱系统，抵御外界环境的变化。

表1 胁迫下青薯9号叶片差异蛋白的质谱鉴定结果

表2 对照青薯9号叶片差异蛋白的质谱鉴定结果

费乌瑞它共鉴定出34个差异蛋白(表3、表4)，可将它们分为5类(图4)，分别为：(1)光合作用相关蛋白7个(占 20.59%)，其中胁迫处理鉴定出的有3个，对照处理鉴定出4个；(2)物质和能量代谢相关蛋白9个(占26.47%)，其中胁迫处理鉴定出的有4个，对照处理鉴定出5个；(3)抗氧化和防御相关蛋白8个(占23.53%)，其中胁迫处理鉴定出的有4个，对照处理鉴定出4个；(4)信号传导和生长发育9个(占26.47%)，其中胁迫处理没有鉴定出，对照处理鉴定出9个；(5)未知功能蛋白1个(占2.94%)，其中胁迫处理的有1个，对照处理没有鉴定出。

表3 胁迫下费乌瑞它叶片差异蛋白的质谱鉴定结果

由表3、表4和图4可知，费乌瑞它在胁迫处理下其差异蛋白质点的表达数量少于对照处理，干旱胁迫使相关酶降解，从而使费乌瑞它抗旱性降低。

3 讨论

3.1 光合作用相关蛋白

光合作用是绿色植物吸收阳光的能量，同化CO2和H2O，制造有机物质并释放氧气的过程，是地球上最重要的化学反应，又是一个极为复杂的，包括一系列光化学步骤和物质转变过程，包括羧化阶段、还原阶段和更新阶段[14]。

核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶(ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)是植物进行光合作用羧化阶段固定CO2的关键酶，广泛存在于叶绿体中，肩负着光反应CO2固定和暗反应CO2释放的双重功能，对光合作用的效率有着非常重要的意义[15-16]；叶绿体转酮醇酶(transketolase，TK)是植物光合作用卡尔文循环中的关键酶，参与光合作用中碳的固定，是植物最大光合速率的限制因子[12，17]；碳酸酐酶也与光合作用密切相关，能催化细胞质中的碳酸氢盐转换为CO2，增加细胞内CO2浓度，进而提高Rubisco的固碳效率[16，18]；氧不断变化的增强蛋白2(OEE2)属于光系统Ⅱ(PSⅡ)放氧族复合物，催化水裂解而放出氧气，对维持光系统Ⅱ的稳定性和放氧能力起重要作用[16，19]；铁氧还蛋白-NADP还原酶参与光系统的循环电子传递，催化电子从还原态的铁氧还蛋白传递给NADP+，生成的还原力NADPH主要用于卡尔文循环中的CO2固定和叶绿体的其他代谢过程[20-21]；细胞色素b6-f复合体是类囊体膜上可分离的多亚基膜蛋白，它的主要功能是参与光系统Ⅰ(PSⅠ)和光系统Ⅱ(PSⅡ)之间的电子传递，其组成成分细胞色素b6-f复合物铁硫亚单位是光合自养生物所必需的蛋白[22]。

表4 对照费乌瑞它叶片差异蛋白的质谱鉴定结果

本试验中青薯9号在干旱胁迫条件下鉴定出与光合作用相关的蛋白质9个，对照组鉴定出6个，主要包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶、转酮醇酶、质体醛缩酶、碳酸酐酶、铁氧还蛋白-NADP还原酶、氧不断变化的增强蛋白2(OEE2)、NADP-苹果酸酶和核糖-5-磷酸异构酶等在光系统和碳同化中起重要作用的键蛋白。费乌瑞它在干旱胁迫条件下鉴定出与光合作用相关的蛋白质3个，对照组鉴定出4个，主要包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶、碳酸酐酶、NADP-苹果酸酶和细胞色素b6-f复合体铁硫亚基等在光系统和碳同化中起重要作用的蛋白质。青薯9号无论在胁迫条件下和对照条件下鉴定出的蛋白质均比费乌瑞它多，青薯9号在胁迫条件下鉴定出的蛋白蛋白质比对照还多，可见其应对干旱胁迫的能力较费乌瑞它强，青薯9号通过提高一些光合作用关键酶的表达，促进光合作用，从而提高青薯9号的抗旱性。

3.2 物质能量代谢相关蛋白

本试验中，青薯9号在干旱胁迫条件下鉴定出与能量物质代谢相关的蛋白质7个，对照组鉴定出6个，主要包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、ATP合成酶β亚基、ATP合成酶CF1α亚基、ATP合成酶CF1ε链、烯醇化酶同工酶X1、叶绿体锰稳定蛋白、硫胺噻唑合酶、吡哆醛生物合成蛋白PDX1.3、核苷二磷酸激酶等蛋白质。费乌瑞它在干旱胁迫条件下鉴定出与能量物质代谢相关的蛋白质4个，对照组鉴定出5个，主要包括甘氨酸脱氢酶、ATP合成酶CF1ε链、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、吡哆醛生物合成蛋白PDX1.3、磷酸丙糖异构酶等蛋白质。

干旱胁迫下植物体内的各种物质能量代谢平衡被打破，为了维持正常的生理活动，各种代谢过程需要调节来抵御、响应干旱胁迫。ATP合成酶广泛存在于线粒体、叶绿体、细胞核中，是生物体能量代谢的关键酶，在细胞物质运输、信号传导、物质合成与分解等代谢活动中起决定作用[16]；青薯9号在胁迫条件下鉴定出3个与ATP合成酶相关的蛋白，为干旱条件下各类代谢活动提供动力。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDHs)在细胞的碳代谢中起着核心作用，是维持生命活动能量形成的最基本酶之一[23]。

3.3 抗氧化和防御相关蛋白质

青薯9号在干旱胁迫条件下鉴定出与抗氧化和防御相关的蛋白质5个，对照组鉴定出3个，主要包括渗调蛋白、热休克蛋白18、L-抗坏血酸过氧化物酶、病原相关蛋白、硫氧还蛋白过氧化酶、蛋白质二硫键异构酶、乳腺谷胱甘肽裂合酶等蛋白质。费乌瑞它在干旱胁迫条件下鉴定出与抗氧化和防御相关的蛋白质4个，对照组鉴定出4个，主要包括渗调蛋白、70 ku热休克蛋白、病原相关蛋白、22.7 ku热休克蛋白、谷氧还蛋白、硫氧还蛋白、41 ku叶绿体茎-环结合蛋白等蛋白质。相关研究表明，提高植物体内抗氧化酶类代谢的水平是增强植物抗逆性的途径之一[24]。渗调蛋白[25]、热休克蛋白[16，26]、病程相关蛋白[16]等干旱胁迫响应蛋白在胁迫条件下的表达量增加，对提高植物的抗逆性具有重要意义。干旱胁迫下植物体内氧化还原平衡状态会被打破，积累对植物有毒害作用的活性氧，植物可通过抗氧化酶系统等保护机制来清除活性氧，其中硫氧还蛋白[27]、L-抗坏血酸过氧化物酶[26]、谷氧还蛋白[26]等的增量表达，对植物本身稳固过氧化物酶体、清除活性氧，积极应对干旱胁迫有重要意义。

3.4 信号传导、生长发育相关蛋白质

青薯9号在干旱胁迫条件下鉴定出与信号传导、生长发育相关的蛋白质3个，对照组鉴定出5个，主要包括上游元件结合蛋白、Harpin结合蛋白、富含甘氨酸RNA结合蛋白、60S酸性核糖体蛋白P0、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP2A-5催化亚基、NAC转录因子等蛋白质。费乌瑞它在干旱胁迫条件下鉴定出与信号传导、生长发育相关的蛋白质0个，对照组鉴定出9个，主要包括33 ku核糖核蛋白、29 ku核糖核蛋白B、富含甘氨酸RNA结合蛋白、线粒体加工肽酶α亚基、延伸因子等蛋白质。

富含甘氨酸RNA结合蛋白是植物中的一种高丰度蛋白质，参与干旱等逆境的反应调节[28]；NAC转录因子是一种重要的调控因子，参与植物生长发育、多种防御反应以及激素信号转导等各种生理活动，受干旱等胁迫的诱导表达，参与植物的胁迫应答[28]，在植物抗旱、高盐等非生物逆境胁迫中起重要作用，一些NAC基因可正向或负向调控植物对干旱、高盐胁迫的耐受能力[29]。

综上所述，2个品种盛花期叶片中共鉴定出81个差异蛋白质，其中78个有明确生理功能。耐旱性强的品种“青薯9号”共鉴定出45个差异蛋白质，包括光合作用相关蛋白(15个)、物质能量代谢相关蛋白(14个)、抗氧化和防御相关蛋白(8个)和信号传导、生长发育相关蛋白(8个)等；耐旱性弱的品种费乌瑞它共鉴定出33个差异蛋白质，包括光合作用相关蛋白(7个)、物质能量代谢相关蛋白(9个)、抗氧化和防御相关蛋白(8个)和信号传导、生长发育相关蛋白(9个)等；由此可见，干旱胁迫对耐旱性弱的马铃薯品种影响更大，2个品种对干旱胁迫的响应调控途径不同。植物对干旱胁迫的响应存在着非常复杂的生理生化过程，表现在多路径和水平的调控上，本试验只对盛花期马铃薯叶片在干旱胁迫下蛋白质组的响应情况作了初步研究，一些干旱胁迫相关蛋白的具体功能还不十分清楚，因此，还需要借助一些新的技术和手段对马铃薯的抗旱机制进行进一步研究，寻找关键抗逆基因，解析马铃薯应答干旱胁迫等逆境的分子机制。

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