三亚地区神经症状患者莱姆病血清筛查分析*

李 沙，陈 婷，李 欢，俞书义，陈 海，朱 雄

(海南省三亚市人民医院检验科 572000)

莱姆病是一种由蜱叮咬传播的人兽共患病，其致病病原体为伯氏疏螺旋体。病原体进入机体后早期表现为皮肤游走性红斑、流感样症状、关节痛、肌肉痛、胸痛等症状，晚期可表现为面神经炎、脑膜炎、面神经麻痹、肢体麻木等神经系统受损[1-2]。莱姆病已在全球70多个国家报道，分布广泛。我国莱姆病主要集中在东北林区，但南方许多省份也有报道。有学者已证实海南存在莱姆病病原体感染[3]。三亚作为海南省国际旅游岛的中心城市，人口聚集日益上升。海南省大部分1级或2级医院临床医师对莱姆病不了解甚至不知道。现探讨三亚地区莱姆病感染情况，为临床诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2013年3―8月该院因神经系统症状就诊患者的外周静脉血5 mL，分别编号和登记，离心分离血清置―20 ℃低温冰箱保存待检。

1.2仪器与试剂 羊抗人免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)荧光抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgM和SPA，均购自美国Sigma公司。PD91菌免疫兔血清、莱姆病抗原片和蛋白免疫印迹法(Western blot)膜条由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所莱姆病室提供。

1.3莱姆病抗体检测

1.3.1间接免疫荧光试验(IFA) 采用PD91菌株常规制备抗原片，将血清用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01 mmol/L，pH 7.2)从1∶16开始倍比稀释。在荧光显微镜40×10视野下，50%以上螺旋体染上明亮荧光，抗体效价达到IgM≥1∶64或IgG≥1∶128者为阳性。同时做阴性和阳性对照。阴性对照为PBS，阳性对照为PD91菌免疫兔血清。

1.3.2Western blot 将IFA法初筛的阳性标本，进一步使用Western blot检测。应用PBS-T以1∶25稀释血清并浸泡抗原条，震荡4 h，洗脱5次，每次至少10 min，将抗原条分别加入2抗IgG或IgM，过夜。再经过洗脱5次，每次至少10 min，加入显色剂显色30 min。显色结束用纯水终止反应。阴性对照为PBS-T，阳性对照为PD91菌免疫兔血清。Western blot结果根据《中国莱姆病WB诊断标准》进行判定。

2 结 果

2.1IFA法检测实验结果 采用IFA方法对251例神经系统症状患者的血清莱姆病抗体进行检测，荧光显微高倍镜下50%视野显示明亮菌体荧光为阳性，其中IgG抗体阳性31例，IgM抗体阳性14例，IgG和IgM抗体同时阳性3例，阳性率16.73%。见图1和表1。

注：箭头所指为高倍镜视野下PD91伯氏疏螺旋体显示绿色荧光，50%视野显示菌体荧光为阳性

图1 IFA法检测血清莱姆病抗体菌阳性(40×10)

2.2Western blot复检实验结果 251例患者通过IFA法检出阳性42例，对42例阳性标本进行Western blot复检，结果显示IgG抗体阳性7例，IgM抗体阳性5例，IgG和IgM抗体同时阳性2例，感染率为3.98%。见表2。

表1 251例神经症状患者血清莱姆病IFA实验结果

表2 42例IFA阳性患者的Western blot复检结果

2.3251例患者的神经系统临床表现 Western blot复检10例莱姆病患者中，面神经炎1例，面神经麻痹2例，脑实质损害5例，肢体麻木2例等感觉异常表现。见表3。

表3 251例神经系统症状患者不同的临床表现

3 讨 论

莱姆病是由伯氏疏螺旋体引起的一种蜱媒螺旋体病，传播媒介主要是几种近缘硬蜱，通过蜱叮咬将病原体传播人群而发病[4-5]。该病是一种多系统受损的综合征，除表现皮肤慢性游走红斑，心脏受损，关节症状外，还可出现复杂的神经系统症状[6]。神经系统损害是莱姆病最严重的临床表现之一，伯氏疏螺旋体具有高度的嗜神经性，不仅可引起神经系统症状，还可长期潜伏中枢神经系统，在不同阶段表现出不同的神经螺旋体病，严重影响患者的生活质量。调查神经系统症状患者的莱姆病情况，可为临床提供一个警示和参考。

自1975年发现莱姆病以来，至今世界上已有四大洲、70多个国家有该病报道[7]。我国于1986年首次在黑龙江省海林县林区发现莱姆病[8]。近年来调查表明，我国存在较广泛的莱姆病自然疫源地。患病率较高的地方主要集中在东北三省、内蒙古大兴安岭林区、新疆天山、长江中上游山林地区。南方地区如湖南、湖北、福建等地都报道了该病的存在。海南省作为中国最南端的省份，在2011年就有学者报道了蜱感染疾病[9]。2015年也有学者对海南省关节炎和神经症状患者进行血清莱姆病伯氏疏螺旋体抗体筛查，采用IFA法筛查，进一步使用Western blot确证，然后对阳性患者血清提取DNA和PCR，产物进行基因测序分析，确证海南省存在莱姆病[3]。本研究调查三亚地区251例神经系统症状患者的莱姆病情况，结果显示IFA法初筛阳性率为16.73%，Western blot确证感染莱姆病10例，感染率3.98%，表明三亚地区存在神经系统症状的莱姆病患者，提示临床对该类患者应考虑是否患莱姆病。

本研究结果表明，IFA法检测251例血清莱姆病抗体，初筛阳性率为16.93%，而Western blot检测阳性率为3.98%，IFA法阳性率高于Western blot的原因是，IFA法与钩端螺旋体、梅毒螺旋体有交叉反应，而Western blot抗原膜片为伯氏疏螺旋体的特异性抗原。有学者通过IFA法和酶联免疫吸附试验法分析827例疑似莱姆病患者的血清伯氏疏螺旋体抗体发现，阳性135例，阳性率16.32%，其中神经系统症状患者344例，阳性88例，阳性率为25.6%[10]。如果通过Western blot检测患者血清存在伯氏疏螺旋体抗体，再结合临床症状和蜱叮咬史，基本可以确诊患有莱姆病。

本研究认为三亚地区存在莱姆病，可为临床提供参考。据三亚市国土环境资源局的统计数据显示，2015年三亚的森林覆盖率达68%，当地存在大量林区工人和护林人员，林区作业者是莱姆病易感人群，感染源为含有伯氏疏螺旋体的蜱，通过叮咬传播。本研究下一步目标将根据患者的住所和作业环境溯源，捕捉当地的蜱，进行病原学培养。若能成功培养伯氏疏螺旋体，将成为该地区是莱姆病自然疫源地的直接证据。

参考文献

[1]孙红胜，胡乃文．莱姆病的临床表现[J]．山东医药，2012，52(43)：90-91.

[2]CAMERON D J,JOHNSON L B,MALONEY E L.Evidence assessments and guideline recommendations in Lyme disease:the clinical management of known tick bites,erythema migrans rashes and persistent disease[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2014,12(9):1103-1135.

[3]朱雄，张琳，侯学霞，等．海南省关节炎和神经系统疾病患者莱姆病调查[J]．中国人兽共患病学报，2015，31(4)：353-356.

[4]SANCHEZ J L.Clinical manifestations and treatment of Lyme disease[J].Clin Lab Med,2015,35(4):765-778.

[5]MEAD P S.Epidemiology of Lyme disease[J].Infect Dis Clin North Am,2015,29(2):187-210.

[6]HALPERIN J J.Nervous system Lyme disease[J].Infect Dis Clin North Am,2015,29(2):241-253.

[7]SHAPIRO E D.Borrelia burgdorferi (Lyme disease)[J].Pediatrics in Review,2014,35(12):500-509.

[8]艾承绪，温玉欣，张永国．黑龙江省海林县林区莱姆病的流行病学调查[J]．中国公共卫生，1987，6(2)：82-85．

[9]金玉明，张丽娟，孙莲英，等．海南省澄迈县新发斑点热流行病学调查[J]．疾病监测，2011，26(1)：18-22．

[10]耿震，侯学霞，郝琴，等．827例拟诊莱姆病患者抗伯氏疏螺旋体抗体检查结果分析[J]．中国媒介生物学及控制杂志，2007，18(3)：219-221.