贵州黑山羊魏氏梭菌和链球菌双重感染的诊治

陈学忠

（贵州省关岭布依族苗族自治县草地畜牧业发展中心，关岭 561300）

羊梭菌性疾病（Clostridiosis of sheep）包括羊快疫、羊肠毒血症、羊猝狙、羔羊痢疾和羊黑疫等，是因梭状芽胞杆菌属（Clostridium）中的细菌感染引起的一类急性传染病［1］。由魏氏梭菌引起的羊病称之为魏氏梭菌病，魏氏梭菌（Cl.welchii），又称产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），菌体呈直杆状，两端钝圆，革兰氏阳性菌，属于腐生性厌氧芽孢致病菌，是引起畜禽猝死症、肠毒血症、坏死性肠炎、气性坏疽的主要致病菌［2］。感染魏氏梭菌后家畜死亡率高达70%～100%，且不同菌型的魏氏梭菌常混合感染，药物治疗效果不明显［3-4］。链球菌（Streptococcus）为一种呈链状或成对存在的革兰氏阳性球菌，多个种的链球菌具有强致病性，常是人兽共患病的病原［5］。在猪、牛、羊等动物中，链球菌不仅可以引起败血症及乳房炎，也是引起肺炎的重要病原性细菌之一，给养殖业造成严重的经济损失的同时，亦引起严重的公共卫生问题。近年来，山羊养殖业不断向规模化方向发展，但各种山羊的传染病，特别是呼吸道疾病的发病率不断上升，给山羊养殖业的健康发展造成了严重影响［6］。

2017年9月中旬，贵州某黑山羊养殖户送临床症状相似的发病羊3只到关岭布依族苗族自治县畜牧服务中心实验室诊断。发病黑山羊表现为呼吸急促、口吐白沫、体温升高、大便带血等。通过临床症状、病理解剖、细菌学检测和支原体PCR技术诊断，确诊为魏氏梭菌和链球菌混合感染。

1 临床症状

发病羊表现为精神萎靡、呼吸急促、消瘦、磨牙，体温升高，脉搏每分钟80～110次，呼吸每分钟25～35次，并出现独处、卧地不愿走动，强行驱赶时行动迟缓，腹部臌胀，有的排粪困难，有的里急后重，大便溏稀，并夹有黏液和脱落的黏膜，间有血丝，随即口吐大量白色泡沫，很快倒地死亡，发病母羊6只全部急性死亡。

2 剖检变化

剖检发现病死羊心尖及心耳有瘀斑；肺脏部分出血、水肿（图1）；真胃胃底黏膜有大面积充血、出血（图2）；肝脏表面有不同程度的斑块，边缘出现梗塞性坏死（图3）；脾脏肿大，有白色坏死灶（图4）；肾脏被膜出血，有坏死灶；病死羊肛周粘有带血丝粪便，各肠段黏膜均有不同程度的充血、出血现象，黏膜组织水肿；肠系膜及肝脏上有数个细颈囊尾蚴（水铃铛）。

图1 肺脏病变及坏死

图2 真胃黏膜充血、出血

图3 肝脏边缘坏死、肿胀

图4 脾脏肿大、有坏死灶

3 实验室诊断

3.1 细菌分离培养

无菌采集送检羊的心、肝、脾、肺、肾、血液进行细菌分离培养，即接种普通营养琼脂平板，于37℃、5%CO2需氧/厌氧培养24～48 h。发现在普通琼脂平板上有A菌表面光滑、半透明、圆形中央隆起的菌落，且只在厌氧培养中生长，B菌的菌落较小，在需氧和厌氧环境中均能生长。然后再将其单个菌落接种于血液琼脂平板上可见A菌呈现圆形、边缘整齐、中央隆起、灰白色、半透明的大菌落，菌落周围有棕色溶血环，有的有双溶血环；B菌在血琼脂平板上生长好，能长出灰白色、圆形、透明、闪光、中央隆起、表面光滑露珠状小菌落，菌落周围呈β溶血。挑取典型单个菌落涂片、革兰氏染色、镜检可见到两端钝圆的蓝紫色革兰氏阳性、短粗的杆菌（图5）和革兰氏阳性链状球菌（图6）。

图5 10×100倍油镜下革兰氏阳性杆菌

图6 10×100倍油镜下革兰氏阳性球菌

3.2 细菌的生化特性鉴定

将分离纯化的细菌在无菌条件下分别进行葡萄糖、甘露醇、甘露糖、N乙酰葡胺、木糖醇、蕈糖、精氨酸水解、果糖、木糖、硝酸盐、蔗糖、蔗糖、尿素、山梨醇、乳糖、麦芽糖等发酵实验，硫化氢实验，靛基质实验，明胶液化实验和含铁牛乳实验。其中有A菌可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖产酸产气，硫化氢实验呈阳性，靛基质实验呈阴性，明胶液化实验为阳性，但不发酵木糖、甘露醇、山梨醇，在含铁牛乳实验中，分解乳糖产酸，出现“汹涌发酵”现象。符合梭菌的生化指标。B菌可以发酵果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖产酸产气，葡萄糖实验呈阳性，木糖醇实验呈阴性，硝酸盐实验为阴性。符合链球菌的生化指标。

3.3 支原体的PCR检测

无菌解剖采集2只死亡病羊的肺脏，适量取样研磨后反复冻融3次，匀浆器磨20min后收集匀浆，12 000 r/min离心10min，取上清，并与采集的病死羊血液一起分别提取DNA（按支原体PCR检测核酸提取试剂盒使用说明书）。用支原体PCR检测试剂盒（购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）进行PCR核酸检测。反应体系（总体积 20μL）：16μL PCR 反应液，2μL Taq DNA 聚合酶，2μL 模板 DNA。PCR 扩增程序：94℃ 3min；94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35 个循环；72℃ 延伸 10min。反应结束后取5μLPCR产物于1%的1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测（90 V，35min），用凝胶成像系统拍照记录。其结果为：病料中未检测出支原体特异性阳性条带，表明发病羊无支原体感染。

4 确诊

根据临床诊断、病理解剖诊断、细菌染色镜检、分离培养、生化鉴定及支原体病毒核酸PCR检测，确诊发病黑山羊为链球菌与魏氏梭菌的混合感染。

5 治疗

针对魏氏梭菌和链球菌感染，建议发病羊场首先对发病羊隔离饲养，并对全群免疫羊三联四防疫苗；免疫时，不论羊个体大小一律肌肉注射或皮下注射1mL，注射后14 d产生免疫力，免疫期1年。用青霉素配磺胺类药治疗为主，早期治疗每次使用青霉素的量为80万～160万IU，肌肉注射，每天2次；使用磺胺类药物治疗时按40～60mg/kg，首次加倍，并给每只羊开以下中药处方：黄连5 g，黄芩5 g，栀子5 g，黄柏5 g，银花5 g制粉水煎15min饲喂调理，同时用黄芪多糖肌肉注射，以增强其免疫力，严重患病羊只直接淘汰。针对细颈囊尾蚴的感染，对粪便进行发酵处理，以杀死幼虫；每月驱虫，皮下注射阿维菌素0.2mg/kg或0.6mg/kg混饲。另外，加强环境卫生管理，保持地面整洁，做好圈舍的预防消毒，保障供给清洁饮水。改善饲养环境，避免拥挤而相互攻击；减少围栏粗糙墙面，避免擦伤。特别注意保持母羊舍环境的清洁、干燥，尽可能安排在春、秋天气温暖干燥的季节产仔，可减少病菌的感染。根据以上方法治疗控制后，新发病羊只明显减少，对该羊场发病起到了一定的控制作用，2个月后该羊场未见新病例。

羊魏氏梭菌病无明显季节性，在人工饲养条件下，由于饲料、换季、环境等突然变化及与人接触，导致羊抗病力下降，肠道菌群失调，羊感染魏氏梭菌后导致机体抵抗力下降进而继发感染链球菌，并且这两种病菌有较强的环境适应能力，从而引起魏氏梭菌和链球菌混合感染。用烧碱水对污染的圈舍和四周水沟等环境进行严格消毒，消毒药品至少要有2种以上含有不同成分的药物交替使用，以免产生耐药性；同时合理搭配饲料，增强羊机体抗病能力，还要加强管理，保证食物卫生，营养均衡。

［1］ 陈溥言.动物传染病学［M］.5版.北京：中国农业出版社，2006：315-320.

［2］ 孟霞，孙翠平，唐娜，等.一株山羊魏氏梭菌的分离鉴定及其致病性研究［J］.中国畜牧兽医，2015，42（7）：1905-1909.

［3］ 罗毅.奶牛魏氏梭菌病病原的分离鉴定鉴定［J］.中国动物检疫，2011，28（8）：61-62.

［4］ 陈小平，李施钟.山羊魏氏梭菌混合感染的防治［J］.云南畜牧兽医，2008（5）：27.

［5］ Keith E R，Murdoch D R.Antimicrobial susceptibility profile of Streptococcus pseudopneumoniae isolated from sputum［J］.Antimicrobial Agents&Chemotherapy，2008，52（8）：2998.

［6］ 谢珊珊，刀筱芳，祝存录，等.山羊源链球菌的分离鉴定及其药物敏感性分析［J］.黑龙江畜牧兽医，2015（15）：171-173.