河南中牟县奶牛片形吸虫感染情况调查及种类鉴定

刘复生

（河南省中牟县动物疫病预防控制中心，中牟 451450）

片形吸虫属于片形科、片形属，该病呈世界性广泛分布，是一种对牛羊、骆驼等反刍动物和人类危害严重的人畜共患性寄生虫病之一［1］。据相关报道，全球约有7亿经济动物感染片形吸虫，给相关养殖业造成极大的经济损失；此外，近些年来关于人感染片形吸虫病的报道也较多，在被调查的60余个国家与地区中，约200万人感染有片形吸虫病，其中我国云南宜宾县也有关于暴发片形吸虫病感染人类的报道［2-3］。河南省是我国奶牛主要养殖地区，为了促进奶牛养殖业的健康发展，本次研究通过对中牟县奶牛进行片形吸虫病流行学调查，对片形吸虫线粒体nad1基因进行扩增与分析，鉴定该地区片形吸虫的种类，为该病的进一步防制提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品来源

此次研究所调查的4个奶牛场分别来自河南省中牟县韩寺镇、万滩镇、白沙镇、大孟镇，从每个奶牛场中随机抽选60份新鲜粪便样品，共240份，每份样品50 g左右，分别标记后置于封口袋，待检。

1.2 虫卵形态学鉴定

分别从每个封口袋中取出粪便40 g左右，利用尼龙袋集卵法收集虫卵，吸取沉渣后在光学显微镜下检测，并参考相关文献，进行初步形态学鉴定［4］。

1.3 PCR扩增

对获得的片形吸虫虫卵进行分子生物学鉴定，用Omega生物技术公司生产的DNA提取试剂盒提取绦蚴虫的DNA基因组，以PCR技术对虫卵线粒体nad1基因序列进行扩增，通过序列分析对虫卵进行分子学鉴定。其中引物利用宋慧群等［5］设计的引物，上游引物F：5’-AGATTCGTAAGGGGCCTAATA-3’（21 bp），下游引物 R：5’-ACCACTAACTAATTCACT TTC-3’（21 bp），引物委托上海生工生物技术有限公司合成。采用25 μL 扩增体系：ddH2O 13.75 μL，MgCl24 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0μL，上下游引物（50 pmol/L）各 0.25 μL，DNA聚合酶 0.25μL，模板DNA 2μL，混匀后低速离心，并作空白对照。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性 30 s，50℃退火 30s，72℃延伸 30 s，35 个循环，72℃后延伸5 min。取5μL扩增产物进行1.0%凝胶电泳，将阳性样品回收后送至上海生工生物技术服务有限公司测序。

1.4 nad1基因序列测定和序列分析

将所获得的样品测序结果用DNAStar 5.0软件分析，并从GenBankTM上搜索现有的片形吸虫nad1基因序列，进行同源性比较。以猪蛔虫（Ascaris suum）作为外群，利用Clustal X1.8及Mega 4.1程序中的邻接法（Neighbor-joiningmethod，NJ）绘制种系发育树。邻接法在软件默认设置下进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同地区奶牛片形吸虫流行学调查结果

通过对不同地区共240份奶牛粪便样品的检测，结果发现：共有13份样品检测为阳性，阳性率5.41%；韩寺镇、万滩镇、白沙镇、大孟镇4个镇奶牛场奶牛片形吸虫感染率分别为5.0%、3.30%、6.67%和6.67%。详见表1。

表1 不同地区奶牛片形吸虫流行学调查结果

2.2 不同发育阶段奶牛片形吸虫流行学调查结果

通过分析不同生长阶段奶牛群感染片形吸虫病的特点，发现各生长阶段奶牛群都可以感染片形吸虫，其中以1岁以下的犊牛感染率最低，为3.12%；2岁以上的成年牛的感染率最高，为6.50%；1～2岁的奶牛感染率居中，为4.71%。详见表2。

表2 不同年龄奶牛片形吸虫流行学调查结果

2.3 PCR扩增结果

13个片形吸虫样品成功扩增出约440 bp的片段，与预期片形吸虫nad1目的片段大小相符，未出现非特异性条带，且空白对照为阴性，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

图1 片形吸虫线粒体线粒体nad1基因序列PCR扩增产物电泳分析

2.4 测序与序列分析结果

测序结果显示，13个片形吸虫样品均成功扩增出nad1基因片段，大小基本一致，为442～446 bp，通过与GenBank中所收录的片形吸虫相关的nad1序列（EF612491.1、EF612492.1、EF612494.1 与 EF612496.1）进行同源性对比。结果发现：1个片形吸虫样品检测为肝片吸虫，12个样品检测为大片吸虫，其中肝片吸虫分离株nad1序列与GenBank中收录的肝片吸虫（EF612494.1和EF612496.1）同源性分别为98.7%和99.3%，12个大片吸虫分离株nad1与GenBank中收录的大片吸虫（EF612491.1和EF612492.1）同源性分别为98.6%～99.3%和99.2%～99.8%。使用Mega 4.1软件的邻位相连法（Neighbor-Joining，NJ）构建序列的种系发育树（图2），通过种系发育分析，结果显示，12个片形吸虫分离株与GenBank中收录的大片吸虫（EF612491.1和EF612492.1）位于同一大分支，1个片形吸虫分离株与GenBank中收录的肝片吸虫（EF612494.1和EF612496.1）位于同一大分支，得到了很好的鉴别。详见图2。

图2 基于nad1基因序列所构建的自展一致树

3 讨论

本次调查结果显示，中牟县奶牛片形吸虫病感染率5.41%，调查结果明显低于湘东地区奶牛片形吸虫病感染率（21.43%）［5］，但高于广西地区奶牛片形吸虫病感染率（0）［6］，这说明不同地区奶牛片形吸虫流行情况差异较大。通过分析不同生长发育阶段奶牛群片形吸虫病感染情况，调查发现，1岁以下犊牛的感染率最低，为3.12%，而1～2岁和2岁以上奶牛群感染率偏高，分别为4.71%和6.50%。

为了明确中牟县奶牛片形吸虫的种类，本次研究在对研究所获得的13个片形吸虫样品分离株进行了nad1基因序列扩增与分析，进行准确的分子鉴定。结果显示，扩增所得到的13个片形吸虫样品分离株线粒体nad1基因序列长度基本一致，为442～446 bp，其中肝片吸虫分离株nad1序列与GenBank中收录的肝片吸虫（EF612494.1和EF612496.1）同源性分别为98.7%和99.3%，12个大片吸虫分离株nad1与GenBank中收录的大片吸虫（EF612491.1和EF612492.1）同源性分别为98.6%～99.3%和99.2%～99.8%，可以初步确定中牟县奶牛片形吸虫种类主要为肝片吸虫和大片吸虫，其中大片吸虫为优势虫种，通过构建系统种系发育树也确定了这一结果。本次研究对中牟县乃至河南省奶牛片形吸虫病的诊断和防制及进一步分子学研究奠定了坚实的基础。

［1］ 陈芳玲，任佳丽，卢秀红，等.间接ELISA检测百色地区牛片形吸虫感染情况［J］.广西畜牧兽医，2015，31（2）：84-86.

［2］ Valero M A，Perez-CrespoI，Periago M V，et al.Fluke egg characteristics for the diagnosisof human and animal fascioliasis by Fasciola hepatica and F.gigantica［J］.Acta Trop，2009，111（2）：50-159．

［3］ 顾伟，苏慧勇，邹静，等.云南省首次暴发巨片形吸虫感染的临床诊治分析［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2012，30（6）：455-459.

［4］ 汪明.兽医寄生虫学［M］.北京：中国农业出版社，2005：226-234.

［5］ 何德肆，胡述光，欧阳叙向，等.湘东地区五个奶牛场寄生虫病感染情况调查［J］.中国兽医寄生虫病，2004，12（1）：11-14.

［6］ 韦志峰，覃勇，陆以全，等.广西水牛和奶牛寄生虫感染情况的调查［J］.中国畜禽种业，2015（4）：3-5.