白及无菌苗繁育技术优化研究

项彬 ，李湘英 ，方笑中 ，肖圆 ，史廷先 ，

（1.黄山峰源生物科技有限公司，安徽 黄山245600；2.祁门县木材公司，安徽 黄山 245600；3.祁门县林业局，安徽 黄山245600）

白及（Bletilla striata）为兰科白及属多年生草本植物，植株高20～60 cm。世界范围内白及属植物共有6种，主要分布在缅甸、中国和日本。我国有4种，分别为白及、黄花白及（B.ochracea）、华白及（B.sinensis）和小白及（B.formosana）[1]。4 种白及植物中只有白及被载入《中国药典》[2-4]。用白及假鳞茎晒干制成的中药，具有收敛止血、消肿生肌等功效。研究表明，白及具有止血、抗肿瘤、抗菌、促进创伤愈合、促进细胞生长等多种药理活性[5-7]。白及提取物是一种优良的生物高分子材料和优良的药用辅料[5,8-9]。此外，白及在食品、纺织印染、特殊涂料和日用化工等方面也有着巨大的利用价值。

目前，由于野生资源已经非常稀少，白及已被列为我国珍稀濒危物种之一。据苏钛等人调查[2]，野生白及种群密度极小，1～2年的已不多见，3年生及以上的也很难见到。资源严重枯竭，加上药农连年的乱采滥挖，使野生白及产量急剧下降，市场供需矛盾日益突出，野生资源日益短缺。

为解决白及野生药用资源面临的短缺危机，近年来一些科技工作者围绕白及资源和人工繁育开展了白及野生变家种、种子无菌化育苗、无菌苗驯化、大田和林下种植等关键技术研究，总结出了白及培育及驯化、驯化苗栽植、栽后管理等技术，为白及人工栽培创造了有利条件。黄山峰源生物科技有限公司（以下简称“峰源生物公司”）在安徽中医药大学俞年军导师的指导和帮助下，在MS培养基中添加NAA激素、香蕉、马玲薯等物质改良MS培养基，改进初代苗和继代苗接种技术，采用不同光照强度以及温度控制等措施，促成白及组培苗快速生长。通过反复试验，组合配套并优化了白及（无菌）组培苗的繁育工艺流程，提高了白及组培苗繁育效率和质量，培育了大批优质白及种苗，有效推动了祁门县林下经济发展，增加了林地复合经营效益，助推了林区精准扶贫进程。同时，公司还培养了大批操作熟练、业务精通涵盖环境消毒、培养基制备、瓶苗接种、光照培育以及白及苗驯化、林下栽培等方面的技术人才。

1 白及无菌苗繁育概况

峰源生物公司建有洁净度万级以上实验室和工厂化育苗车间3 000 m2，拥有清洗、制备、接种和培育员工36人；新建白及瓶苗驯化基地15 hm2，一期建成大棚30个，二期拟建25个；工厂采用先进的自动控制系统，智能控温、间断光照、无尘控制育苗，年设计生产白及无菌瓶苗100万瓶；现已生产白及无菌继代瓶苗80万瓶，约2 400万株，其中大棚驯化苗约1 000万株。通过改进白及苗组培工艺，优化制备、接种、培养等工序，使白及瓶苗产量更高、质量更好。如按人均每天接种300瓶、转接苗数32株/瓶计算，人均年转接量近11万瓶。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 蒴果处理、培养基配制材料

白及蒴果、超净工作台、10%次氯酸钠溶液、无菌水、75%酒精、不锈钢盘、镊子等；MS培养基、NAA激素、香蕉、马铃薯、蔗糖、琼脂等。

2.1.2 接种与温光控制材料

不锈钢盘、镊子，容积为250 mL培养瓶（瓶中MS培养基量≥62.5 mL）、750 mL培养瓶（瓶中MS培养基量≥125 mL）等，空调系统、强度为2 000～3 000 Lux·m-2·s-1可控光源等。

2.2 方法

2.2.1 蒴果处理、培养基配制

（1）蒴果处理：从冰箱取出白及蒴果，在超净工作台内，用10%次氯酸钠溶液浸泡20 min，期间要不时摇晃，然后用无菌水冲洗3～5遍，再用75%酒精擦拭表面，置于灭菌过的不锈钢盘内风干表面水分备用。

（2）改良MS培养基配制：在MS培养基中分别添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂、50 g/L香蕉果肉、50 g/L马铃薯肉作为白及初代苗培养基；在MS基本培养基中添加NAA 0.5 mg/L后，再分别添加：A、50 g香蕉/L+50 g马玲薯/L；B、只添加 50 g香蕉/L；C、只添加50 g马玲薯/L；D、香蕉、马玲薯均不添加，分别作为白及继代苗培养基。

2.2.2 接种与接种人员

将处理后的白及蒴果剥开，取出细小种子放入无菌盘中，用高温灭菌降温后的镊子夹取一定量的种子，均匀撒播到容积为250 mL培养瓶里（瓶中MS培养基量≥62.5 mL），置于光照培养室培养。接种后1～10 d内统计每天瓶苗污染数量。

转接用瓶苗苗龄＞60 d的初代苗；转接熟练人员分为3组，其中男性1组，女性2组（1组常规接种，另1组使用组培辅助工具支架接种）。接种要求如下：将培养好的初代白及苗转接到750 mL培养瓶里，瓶中MS培养基量≥125 mL，瓶中转接白及初代苗≥32株。每组分别接种上述苗龄白及苗300瓶，标记后送培养室培养，并统计每组接种速度、接种后1～10 d污染数量及40 d后瓶苗质量，确定最快接种组和最优接种方法。

2.2.3 温度与光照控制

转接后的白及瓶苗，由传递人员通过传递窗送至培养室进行光照培养。培养室温度控制在（25±2）℃，光照 12 h，光照强度为 2 500～3 000 Lux·m-2·s-1，培养60 d以上。

3 结果与分析

2.2.4 季节与辅助工具

接种季节不同，其环境温度、空气湿度、单位体积空气中细（真）菌含量、接种室内空气洁净度不同，直接影响到瓶苗污染程度。

接种人员使用辅助工具—一种接种支架，能提高接种速度，相应减少瓶苗污染。

3.1 培养基、激素对白及瓶苗生长及质量的影响

白及种子在自然状态下萌发率很低，通过无菌组织培养，以MS为基本培养基，分别添加蔗糖、琼脂、香蕉果肉、马铃薯肉可大大提高白及种子萌发率。通过本方法的试验，白及接种7～9 d种子开始萌发，20～25 d绝大部分种子萌发。在不添加激素的条件下，播种时添加香蕉、马铃薯处理和不添加香蕉和马铃薯的改良MS培养基上的白及种子萌发时间基本一致，出芽均比较整齐。

待形成原球茎的白及苗高1.5～2 cm，将其转接到分别添加了NAA、香蕉、马铃薯的改良MS培养基中培养，40 d后白及苗高生长达5 cm以上，60 d后可炼苗和驯化。由表1可知，在MS培养中添加0.5 mg/L NAA后，4个处理中，白及转接培养60 d后，苗高、叶宽、假鳞茎等生长指标均存在一定差异。其中处理A在苗高、叶宽、假鳞茎等指标上表现最佳。而处理B和处理C又优于处理D。由此可见，添加了NAA、香蕉和马铃薯的改良MS培养基，更有利于白及继代苗的生长。

表1 不同添加物对白及继代苗生长的影响

3.2 人员对接种速度和瓶苗质量的影响

不同接种人员因接种手法、熟练程度、操作技巧等不同，其接种速度与接种后瓶苗长势及瓶苗质量均有一定差异。由表2可知，接种人员甲8月27日、9月22日和10月20日分别接种60瓶、95瓶和120瓶，而接种人员乙在相同时间里分别接种80瓶、100瓶和125瓶。可见，不同接种人员接种速度是不同的，其单位时间内的接种速度是随接种年（月）龄的增加而增加的。

瓶苗质量除与培养基种类、接种时初代苗大小、质量，培养室光照、温度及培养时间等有密切相关外，还与接种人员技术熟练程度、接种质量有密切联系。如表2所示，接种人员乙技术熟练、接种速度快，其接种的白及苗高、叶长、叶宽等生长指标均较好。

表2 不同接种人员对接种速度和种苗质量

3.3 环境因素对瓶苗生长及质量的影响

3.3.1 温度对瓶苗生长及质量的影响

瓶苗苗龄、接种人员、接种批次、接种数量、培养室光照时间等均相同，培养室最下层培养架上的培养瓶与上面3层培养架上的培养瓶温度略有差异，其生长指标和质量与上面3层相比，存在一定差异。对培养90 d的不同层架上的白及苗生长指标进行了测定和统计，结果见表3。

由表3可知，上面第1层至第3层，瓶苗株数、叶长、叶数、苗高均大于第4层；而叶宽、假鳞茎直径均小于第4层。可见，温度略高，有利于瓶苗高生长和小苗分化；温度略低，有利于瓶苗叶宽和假鳞茎生长。

表3 培养室同架不同层白及苗生长表现

3.3.2 光照对瓶苗生长及质量的影响

由表4可知，在培养室环境温度、培养时间、光照周期等均相同的条件下，白及继代苗在不同光照强度下，其苗高、叶长、叶宽、假鳞茎大小等指标均有一定差异。如光照强度分别为2 500 Lux·m-2·s-1和3 000 Lux·m-2·s-1，每天照射 12 h，培养 90 d，白及苗平均高、叶长、叶宽、假鳞茎直径分别为10.9 cm、11.8 cm，7.3 cm、7.4 cm，0.6 cm、0.7 cm，0.32 cm、0.33 cm，可见，白及苗生长更适宜于3 000 Lux·m-2·s-1光照。

表4 光照强度对白及苗高、假鳞茎等生长指标影响调查

3.4 辅助工具对接种速度及质量的影响

在一定条件下，接种人员使用接种辅助工具——接种支架，能大幅度提高接种速度，减少瓶苗污染，提高瓶苗质量。在超净工作台内放1～2个金属接种支架，分别放初代瓶苗和待接种的继代苗瓶，接种人员从初代瓶中取出小苗，然后直接接种到另一个支架上的继代瓶中。由于使用接种支架减少了取苗、分苗的过程，缩短了白及小苗在空气中的停留时间，提高了转接速度，大大降低了瓶苗的污染率，相应地也提升了转接苗的质量。据测算，使用接种辅助工具，白及苗转接速度由原来的11.25瓶/h，提高到现在的37.5瓶/h，效率提高3倍多。

3.5 季节对瓶苗污染的影响

接种季节（日期）不同，其环境温度、空气湿度、单位体积空气中细（真）菌含量、接种室内空气洁净度不同，转接后一定时期内瓶苗污染率也不相同。由表5可知，不同季节接种的瓶苗，接种后一定时间内瓶苗的污染数量和污染率也不相同。如2016年7月份，工厂刚正式生产，制备室、接种室、培养室等环境优越，空气洁净度高（万级以上），接种后瓶苗污染数及污染率相对较低，日平均污染数为56.3瓶，污染率为8.1%。8月份，因空气含菌量相对增高，环境质量变差，日污染量增加，污染率上升，达到9.3%。

表5 不同接种季节对白及转接瓶苗污染的影响

4 结语与建议

目前，白及苗无菌化人工繁育，大田、杉木、毛竹林下种植及经营期管理技术已日臻成熟[10]，白及种植户已积累了丰富的大田种植经验，如祁门县安凌镇的桂小林，柏溪乡的蒋纪泽等10余户种植白及约1.5 hm2，其中两户2016年已获得可观的经济效益，并辐射带动了一批农户栽植白及。为使白及种植技术规范化、面积规模化、经营集约化、效益最大化，推进各地林下经济发展，加快各地精准扶贫进程，提出以下建议。

4.1 建立林下白及种植示范基地

当地政府应根据区域内林地资源状况、白及种苗供应能力，以及目前已具备的栽培、管理和病虫害防治技术等条件，扶持和鼓励相关企业或种植大户，积极开展纵向或横向合作，走“企业+基地+农户”的发展模式，建立林下白及种植示范基地，开展集约化、规模化经营，提高林地复合经营效益，辐射带动周边乡镇发展林下白及种植，增加林地经营收入，致富山区群众，推进当地经济发展。

4.2 鼓励贫困户开展林下白及种植，推进精准扶贫进程

结合当前党和政府加强扶贫攻坚的大好机遇，解放思想，拓宽思路，创新机制，上牵下联，争取项目资金，鼓励贫困户开展林下白及种植，增加其经济收入，推进当地精准扶贫进程。

4.3 开展林下白及种植技术培训，推广白及与其他中药材复合经营

组织白及种植大户到白及产区进行考察和学习，掌握白及种植与管理技术和经验；白及种苗培育企业，要积极与科研单位建立长期合作关系，并邀请白及研究专家来当地开展技术培训，提高白及种植者经营管理水平；大力推广白及与其他中药材复合经营技术，如白及与覆盆子套种、杉木下套种白及等，增加中药材复合经营效益。

4.4 出台优惠政策，扶持林下经济发展

为鼓励社会各界大力发展林下白及等中药材种植，加快祁门县林下经济发展，政府应积极整合林业、农业、水利、农发、财政和扶贫资金，鼓励并扶持相关企业和中药材种植大户进行林下中药材种植，推进林下经济健康、长足发展，繁荣山区经济，建设生态、美好家园。

参考文献:

[1]中国科学院中国植物志编委会.中国植物志 (第十八卷)[M].北京:科学出版社,1999.

[2]苏钛,邱斌,李云.滇产白及类习用药材资源调查及市场利用评价[J].中国野生植物资源,2014,33(5):49-52.

[3]吴劲松,张宇思,刘薇,等.白及属药用植物DNA条形码的确立及其应用[J].药学学报,2014,49(10):1466-1474.

[4]鞠康,刘耀武,王甫成,等.安徽亳州中药材市场白及品种调查[J].中国民族民间医药,2011,20(17):22-23.

[5]李伟平,何良艳,丁志山.白及的应用及资源现状[J].中华中医药学刊,2012,30(1):158-160.

[6]汤逸飞,阮川芬,应晨,等.白及属植物化学成分与药理作用研究进展[J].中草药,2014,45(19):2864-2872.

[7]赵艳霞,邓雁如,张晓静,等.白及属药用植物化学成分及药理作用研究进展 [J].天然产物研究与开发,2013,25(8):1137-1145.

[8]陆峻波,刘亚辉,杨永红,等.从文献分析看我国白及研究进展 [J].云南农业大学学报:自然科学版,2011,26(2):288-292.

[9]孙达锋,史劲松,张卫明,等.白及多糖胶研究进展 [J].食品科学,2009,30(3):296-298.

[10]罗双林.不同郁闭度和坡位对毛竹林下套种白及的影响[J].安徽林业科技,2016,42(3):14-15.