病理组织免疫组化技术常见问题与质量控制

茅育蕾 陈柏庆

[摘要] 目的 探究皮肤病理组织免疫组化技术的常见问题与操作的质量控制对免疫组化制片质量的影响。 方法 按照随机数字表法将20只雄性6～8周龄的BALB/c小鼠分为观察组和对照组，每组各10只，观察组使用质量控制后的制片法，采用完整免疫组化步骤；对照组使用传统的制片，采用简易免疫组化步骤，比较两组制片质量和免疫组化结果。 结果 观察组制片的质量明显优于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；观察组免疫组化图片质量明显优于对照组。 结论 免疫组化任一环节都可影响免疫组化结果，质量控制可以提升免疫组化技术综合效果，有利于进一步提高病情的临床诊断，值得推广。

[关键词] 皮肤组织；免疫组化；质量控制

[中图分类号] R392.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（b）-0163-04

Common problems and quality control of immunohistochemical technique in pathological tissue

MAO Yulei CHEN Boqing

Department of Pathology， Affiliated Hospital of Shaoxing University Pathology Shaoxing， Zhejiang Province， Shaoxing 312000， China

[Abstract] Objective To investigate the common problems of immunohistochemistry in skin pathology and the influence of quality control on the quality of immunohistochemical preparation. Methods Twenty male BALB/c rats aged from 6 to 8 weeks old were divided into observation group and the control group by random number table， with 10 rats in each group. The observation group was used by the making slices method after quality control and adopted the complete immunohistochemical procedures and the control group with the traditional production method and the simple immunohistochemical procedures. The making slices quality and immunohistochemistry of two groups were compared. Results The making slices quality in observation group was better than control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The quality of the immunohistochemical pictures in observation group was significantly better than the control group. Conclusion Immunohistochemistry can affect the results of immunohistochemistry in any aspect. Quality control can enhance the comprehensive effect of immunohistochemistry， which is helpful to further improve the clinical diagnosis of the disease and it is worth promoting.

[Key words] Skin tissue； Immunohistochemistry； Quality control

免疫組化技术作为临床病理学重要的诊断手段，将病理诊断提升到较高水平，具有广泛而深入的应用，成为病理工作者不可缺少的重要内容[1-3]。免疫组化技术过程包括组织固定、玻片选择、组织切片、抗原修复、抗体选择及应用和显色等，每一步都会影响到制片的质量和临床病理诊断的准确性，因此质量控制必不可少[4-6]。本研究以小鼠皮肤组织为例，比较不同制片、固定、脱水方法对免疫组化染色效果的影响，讨论皮肤病理组织免疫组化技术的标准化操作流程，为严格控制制片质量，获取满意结果提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采用动物室提供的20只6～8周龄BALB/c小鼠，雄性，体重18～22 g，由绍兴市动物研究所提供，合格证：SCXK（苏）2010-0001，于SPF三级动物室饲养，自由饮水，通风良好，昼夜正常变化，室温21～24℃，湿度50%～70%，适应性饲养1周后开始实验。按照随机数字表法将小鼠分为观察组和对照组，每组各10只，取小鼠背部皮肤组织作为研究使用的标本。

1.2 试剂与仪器

甲醛（化试有限公司），二甲苯（化试有限公司），酒精（化试有限公司），组织脱水机（德国，LEICA，TP1020），石蜡包埋机（德国，LEICA，EG1140H），石蜡切片机（德国，LEICA，RM2130），烤片机（德国，LEICA，HI1220），光学显微镜（日本，OLYNPUS）。

1.3 实验方法

实验前2 d采用戊巴比妥钠（80 mg/kg）经腹腔注射麻醉，刮除其背部毛发，形成约2 cm×2 cm大小的暴露区域，单笼饲养2 d后，取小鼠背部正中全层皮肤，约1 cm×1 cm大小。观察组使用质量控制后的病理切片，对照组使用传统的病理切片。将两组免疫组化病理切片进行显微镜下观察比较，并将观察组和对照组的病理资料进行统计分析，找出日常工作中容易出现的常见问题，并详细制订解决的方法，比较观察组和对照组的制片质量及诊断价值。其中每组5只进行PCNA染色，5只进行CD3染色，具体如下：

对照组：按照科室传承经验方式进行操作。①取材后福尔马林固定12～24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋；②常规切片；③石蜡切片烘烤30 min后常规二甲苯脱蜡至水，蒸馏水清洗1次；④PBS清洗1 min，玻片组织上滴加PCNA、CD3的单克隆Ⅰ抗，4℃孵育过夜；⑤次日PBS洗涤3次，每次1 mim后，滴加相应Ⅱ抗，37℃孵育1 h；⑥配制新鲜DAB显色液，玻片由PBS洗涤3次，每次3 mim，经DAB分别染色1、3 min后终止显色；⑦显微镜下观察免疫组化染色结果并拍照记录。石蜡切片烤片时间短，清洗步骤时间、次数减少，且未进行过氧化物酶封闭和抗原热修复。

观察组：采用质量控制的操作。①取材时注意组织的完整性，保持组织原貌，勿挤压；及时用Bouin′s液固定并注意固定液与标本的比例，达到固定充分；根据皮肤组织特点有针对性地进行修取、脱水、透明、浸蜡、包埋，透明时间严格控制在2 h以内，浸蜡温度控制在60～65℃，包埋需要恒温，避免气泡、裂隙出现。②切片时肉眼观察切片是否平整，避免空洞、卷曲，标记清晰，镜下观察切片是否污染，选取质量优质的制片。③石蜡切片65℃烘烤2 h后常规二甲苯脱蜡至水，蒸馏水清洗2次。④95℃枸橼酸钠溶液中水浴加热10 min进行抗原修复。⑤自然降至室温后，3%H2O2室温孵育10 min，PBS洗涤3次，每次3 mim。⑥玻片组织上滴加PCNA、CD3的单克隆Ⅰ抗，4℃孵育过夜。⑦次日PBS洗涤3次，每次3 mim后，滴加相应Ⅱ抗，37℃孵育1 h。⑧配制新鲜DAB显色液，玻片由PBS洗涤3次，每次3 mim，经DAB分别染色1、3 min后终止显色。⑨显微镜下观察免疫组化染色结果并拍照记录。

抗原活性强度用DAB显色表示：完全不着色（-），浅棕色（+），棕色（++），深棕色（+++）。有效制片率=（优质片数量+良质片数量）/总制片数量×100%。病理切片分级标准，见表1。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组制片质量比较

观察组有效制片率为97.50%，对照组有效制片率为80.00%，两组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.2 两组皮肤组织CD3、PCNA免疫组化结果比较

观察组组织结构完整清晰，可清楚分析表皮层、真皮层等，免疫组化着色均匀，阳性点明显无杂质；对照组组织破损严重，着色不均匀，阳性点不明显，杂质较多；对照组背景颜色明显深于观察组。见图1（封四）。

3 讨论

免疫组化技术结合了免疫学、组织学和化学等学科，根据抗原抗体的结合反应与化学显色原理，使组织切片中待测细胞的化学成分通过过氧化物酶等标记出来，便于显微镜的观察与统计，对辅助病理诊断和鉴别诊断有决定性作用[7-8]。然而免疫组化技术在实际操作过程中，受到多种因素的影响，环环相扣，任一环节出现问题，都可导致结果的难以读取或不准确，出现诊断差错[9-11]。为做到免疫组化技术的准确，操作过程要严格执行临床病理操作规范，做到免疫组化流程的標准化。

本研究以小鼠皮肤组织为例，从取材、制片和免疫组化步骤方面对免疫组化技术常见问题与质量控制进行了探讨。首先活检取材需注意组织完整性，可反映病变特征，避免厚薄不均、变性和坏死[12]。组织的固定、脱水、透明、浸蜡和包埋是制片的重要环节。组织固定的目的在于保持细胞原有的形态和成分，防止细胞自溶，常用固定剂为福尔马林和多聚甲醛[13-14]。固定时间随组织的不同而变化，固定不及时、不完全会导致细胞长期缺氧而引发细胞肿胀，改变靶抗原，或导致细胞溶解、抗原丢失，不利于免疫组化结果的可靠性；而固定时间过长也可导致组织脆性增加，影响制片质量，在福尔马林中固定一般不可超过24 h[15]。为了保持组织细胞的原始结构和组织细胞中待测抗原的活性，组织标本必须尽快置于固定液中充分固定，所有的试剂需及时更新，避免影响染色效果。同时，应考虑固定剂质量，包括pH值、浓度、渗透压和缓冲液等[16-17]。

组织固定后，进行脱水、透明、包埋、切片。切片时切片过厚染液不易透过，切片过薄则易碎，且应避免刀痕、气泡、组织折叠等[18]。石蜡切片的干燥必不可少，然而烤片温度过高会导致出现边缘假象，且容易降低抗原的反应性，在石蜡切片制备过程中，由于需要反复经二甲苯、酒精等有机溶剂的浸泡处理以及浸蜡，容易发生飞片现象，应对切片进行充分干燥，防止脱片现象的发生，因此烤片温度一般不高于58℃，时间约为6～12 h，此时对石蜡切片的免疫组化染色结果不会有影响，操作应认真注意[19-20]。

制片过程中，为保持组织细胞结构进行的固定液固定，破坏了细胞内蛋白质的生物活性，为此需进行抗原修复。而抗原修复的步骤，又容易引起组织的飞片、破碎等。因此同时保证这两个条件，需要严格按照标准操作规范，以免影响临床病理诊断[21]。实验过程中，抗原修复是免疫组化的关键步骤，常采用为微波修复和水浴锅修复，用以打开固定液造成的蛋白结合，使抗原暴露，便于提高免疫组化染色的敏感性，以保证获得准确的实验效果[21]。为了去除组织细胞中的杂质干扰，避免非特异性染色，常使用过氧化物酶封闭液方法把其中的杂蛋白去掉，同时避免了背景色的影响。

结合制片过程中的关键步骤，本研究采用了传统制片操作（对照组）和质量控制后操作（观察组），在取材、制片和免疫组化操作上都有所差异。本研究结果提示，观察与与对照组制片质量比较，观察组有效制片率为97.50%，对照组有效制片率为80.00%。对照组的石蜡切片出现较多脱片、褶皱不平和飞片的情况，结合操作步骤，说明在切片、展片的步骤后，石蜡切片的干燥对保持组织的完整性非常重要，同时观察组进行了易造成切片完整性破坏的微波修复，但组织切片的完整性仍优于对照组，再次表明石蜡切片干燥可利于组织与玻片的充分黏合。

显微镜下观察皮肤组织免疫组化结果显示，观察组组织结构完整清晰，可清楚分析表皮层、真皮层等，免疫组化着色均匀，阳性点明显无杂质；对照组组织破损严重，着色不均匀，阳性点不明显，杂质较多。这与对照组实验中清洗时间短、次数少有关，因组织粘贴不牢固，过多的清洗易引起组织脱落，为此减少清洗的强度，导致了清洗不彻底，而出现较多的杂质。观察组与对照组阳性点均为深棕色，观察组阳性点均为颗粒状，大小均一，分布规律，数量较多，但对照组分布散乱，数量少，且成片存在。同时，观察组的非特异性染色明显增多，背景颜色较深，说明抗原修复和过氧化物酶封闭对暴露抗原、减少背景颜色较为重要，通过此步骤可获得较满意的染色效果。

临床应用免疫组化技术，需将各个环节做到标准化，采用标准化程序进行操作，对免疫组化技术进行质量控制，达到病理诊断、预后判断和临床治疗的快速、准確的目的。严格按照标准化和规范化操作，可以提高免疫组化技术水平，做出精确的病理免疫组化结果，提高临床病理诊断的准确率。为了更好的应用免疫组化技术，需要进一步加强对免疫组化的研究，在实际应用中不断的提高免疫组化诊断的效果。

[参考文献]

[1] 邓伟，杨春梅，黄江生，等.科室日常工作中免疫组化组织对照的设计及应用[J].诊断病理学杂志，2014，21（6）：402.

[2] 刘毓玲，张锋，周林，等.免疫组化室内质量控制与评价[J].诊断病理学杂志，2017，24（1）：68.

[3] 成克伦.改良手工免疫组化在病理诊断中的应用[J].中国校医，2017，31（2）：158-159.

[4] 李丽莉，白东亭.免疫组化诊断试剂性能分析研究中质量控制关键问题探讨[J].中国生物制品学杂志，2017，30（9）：993-998.

[5] 刘红伟.免疫组化组织芯片制作及质量控制[J].现代医学与健康研究电子杂志，2017，1（2）：10-11.

[6] 阮顺爱，蔡爱英，林秀香.提高免疫组化染色质量的经验总结[J].中国医药指南，2017，15（20）：33-34.

[7] 冯晨，徐康宁.病理诊断中免疫组化技术的应用探讨[J].世界最新医学信息文摘，2017，17（59）：69-75.

[8] 热米拉·阿不都克力木，葛春鸣.免疫组化检查在病理诊断中的应用及其意义[J].临床医药文献电子杂志，2017， 4（5）：909.

[9] 方雪松.冰冻切片和石蜡切片对免疫组化染色效果的对比分析[J].中外医疗，2017，36（13）：16-18.

[10] 彭大云，赖续文，张伟，等.全自动免疫组化仪在标准化染色质量控制中的应用[J].中国医学装备，2017，14（3）：36-39.

[11] 白艳玉.病理诊断中免疫组化技术的应用研究[J].临床医药文献电子杂志，2017，4（22）：4296.

[12] 程晓菊.质量控制对免疫组化制片技术质量的影响[J].中国社区医师，2017，33（7）：5.

[13] 康世瑾，安淑敏，刘志远，等.免疫组化技术在病理诊断中的应用[J].中国医药指南，2016，14（28）：294.

[14] 刘海霞.免疫组化病理技术质量控制问题分析与对策[J].山西大同大学学报：自然科学版，2016，32（4）：48-50.

[15] 谢远杰，莫中成，李美香，等.免疫组织化学实验技术教学实践与体会[J].基础医学教育，2017，19（2）：123-125.

[16] 张睿，马健波.免疫组化染色防止脱片的几点体会[J].诊断病理学杂志，2016，23（5）：397-398.

[17] 马喆，王洪岩，袁东辉，等.病理免疫组化质量控制过程中应注意的几点[J].诊断病理学杂志，2015，22（3）：187.

[18] 杨梅.免疫组化染色对病理技术质量控制的影响分析[J].中外医学研究，2017，15（19）：72-73.

[19] 王小梅.免疫组织化学技术常见问题分析及改进措施[J].中国继续医学教育，2016，8（30）：50-51.

[20] 陈昱江.免疫组织化学技术在病理诊断中的应用分析[J].中国社区医师，2016，32（26）：115-116.

[21] 于立伟.免疫组织化优点与质量控制[J].中国继续医学教育，2016，8（6）：33-34.

（收稿日期：2017-11-15 本文编辑：万 平）